本文要點：本論文中，研究人員利用單壁碳納米管在1.3-1.4 µm (NIR-IIa)固有發(fā)射，*在不開顱的情況下，實現(xiàn)腦穿透深度>2 mm，空間分辨率達10 µm的無創(chuàng)性腦血管成像；同時以每秒∼5.3幀的成像速率動態(tài)成功記錄腦血管中的血液灌注，并實時監(jiān)測腦卒中模型小鼠的血液動力學分布。

大腦的無損成像對于研究其復雜的功能及相關疾病具有重要作用。與傳統(tǒng)的X光、磁共振等方法相比，光學成像具有掃描時間短、空間分辨率高、無離子輻射、操作簡便等優(yōu)勢備受關注。然而，傳統(tǒng)的可見光及近紅外一區(qū) (NIR-I, 400-900 nm)熒光成像常常需借助于開顱、打骨窗及磨顱骨等手術，這將對腦組織及腦血管造成損傷。近紅外二區(qū)生物成像窗口(1.0 -1.7 µm, NIR-II)減少了組織的光子散射、吸收和自熒光現(xiàn)象, 提供更高的信噪比和更深的組織穿透性，在生物領域中應用備受青睞。美國斯坦福大學戴宏杰教授團隊利用單壁碳納米管(SWNT) 在1.3-1.4 µm (NIR-IIa)固有發(fā)射，*在不開顱的情況下，實現(xiàn)腦穿透深度>2 mm，空間分辨率達10 µm的無創(chuàng)性腦血管成像。

首先，研究人員測試了SWNT-IRDye800共軛物在808 nm激光激發(fā)下的發(fā)射譜圖(圖1a)。其中，IRDye800的發(fā)射波長位于NIR-I窗口(800–900 nm), 而SWNTs的發(fā)射波長位于NIR-II窗口(1.0-1.7 μm)。同時，研究人員利用1 wt% 脂肪乳劑來模擬生物體組織，將充滿SWNT–IRDye800溶液的毛細管浸入其中，當浸入深度達1cm時，僅有NIR-IIa (1.3 -1.4 μm)成像窗口可見尖銳的毛細管邊緣(圖1b)，表明NIR IIa窗口具有較低的光散射。為了進一步闡明脂肪乳劑成像的波長依賴性，研究人員測定了1 wt% 脂肪乳劑的散射系數(shù)與波長關系。結(jié)果表明，光子散射系數(shù)與波長成反比(圖1c)。NIR-IIa 窗口由于避免了短波光子(<1.3 μm) 散射引起的背景信號以及水分子干擾信號(>1.4 μm)，從而大大改善成像效果。

圖1 a、SWNT-IRDye800熒光發(fā)射光譜 (808 nm)。b、 SWNT-IRDye800溶液充滿毛細管浸入1wt% Intralipid中1mm (上)和10mm (下)的NIR熒光圖像。c、1wt% Intralipid在水中的消光光譜(黑色曲線)和散射光譜(紅色曲線)。

其次，研究人員利用SWNT–IRDye800分別在NIR-I、NIR-II和NIR-IIa成像窗口進行了活體小鼠腦成像對比。與NIR-I窗口成像的模糊血管相比 (圖2b)，檢測波長越長，圖像越清晰(圖2c)，尤其是NIR-IIa (1.3 -1.4 μm) (圖2d)。研究人員通過測定小鼠頭皮和顱骨的消光光譜進一步解釋小鼠大腦熒光成像的波長依賴性 (圖2e)。在NIR-IIa波段內(nèi)，頭皮及顱骨的光散射系數(shù)低于傳統(tǒng)NIR-I窗口 (圖2f)，同時避免了頭皮及水分子振動吸收峰干擾 (> ∼1.4μm)，從而使得顱骨下方的皮質(zhì)血管成像得到顯著改善 (圖2d和2b)。

圖2、SWNT-IRDye800在不同近紅外成像窗口的活體小鼠腦成像。a，去除毛發(fā)的C57Bl/6小鼠腦部。b–d，同一小鼠腦部在NIR-I、NIR-II和NIR-IIa區(qū)域的熒光圖像。d，大腦下靜脈、上矢狀竇和橫竇分別標記為1、2和3。e，頭皮(紅色)和頭骨(藍色)的消光光譜以及吸水光譜(黑色)。f，頭皮(紅色)、顱骨(藍色)和腦組織(黑色)的散射系數(shù)μs′與波長作圖。

接下來，研究人員對小鼠腦血管進行高倍顯微成像。為了優(yōu)化單位質(zhì)量注入的納米管的熒光信號，研究人員將納米管中熒光發(fā)射在1.3–1.4 μm波段的半導體納米管分離出來，用于小鼠腦成像(圖3c)。首先，研究人員對小鼠整個頭部進行成像(圖3d)，放大其左半球(圖3e)，并在上矢狀竇皮質(zhì)血管分支附近進行顯微成像。頭皮下方2.6 mm深度處NIR IIa 窗口顯微圖像揭示，許多微小的毛細血管從較大的腦血管分支出來（圖3f）。此外，研究人員通過測定離體的頭皮、顱骨和腦膜總厚度，推測出2.6 mm深度的毛細血管在腦組織內(nèi)的深度為∼1.3 mm，實現(xiàn)了迄今為止報道的分辨率的腦毛細血管非侵入性熒光成像（圖3h-k）。

圖3、小鼠腦血管NIR IIa高倍顯微熒光成像。a、立體定向顯微鏡成像裝置。紅色激光用于校準并顯示光束位置。b、顯示NIR IIa熒光穿透腦組織、顱骨和頭皮的示意圖。c、 半導體納米管在水溶液中的發(fā)射光譜。1.3–1.4 μm NIR IIa區(qū)域為紅色。d、低倍腦血管圖像，視野為25 mm×20 mm。e、d中腦血管圖像放大到左大腦半球，視野為8 mm×6.4 mm。f、用顯微鏡物鏡拍攝同一小鼠頭部的腦血管圖像，視野為1.7 mm×1.4 mm。這些病灶內(nèi)血管特征的深度為2.6 mm。g、放大倍率較高的物鏡拍攝的f子區(qū)域的放大圖像，視野為0.80 mm×0.64 mm。注：沿黃色虛線的橫截面強度分布（黑色）和高斯擬合曲線（紅色）。h–k，在另一只小鼠（h，j）上拍攝的另外兩張視野為0.80 mm×0.64 mm的高分辨率腦血管圖像及其沿黃色虛線（i，k）的橫截面熒光強度分布（黑色）和高斯擬合曲線（紅色）。

后，研究人員對正常小鼠與左腦中風小鼠(MCAO) 進行了腦血流灌注的動態(tài)NIR-IIa成像；并根據(jù)血流動力學差異來區(qū)分動脈血管和靜脈血管。與正常小鼠(圖4a-c)相比，MCAO小鼠(圖4g-i)右半球顯示出與正常小鼠非常相似的血流，而左半球卻顯示出明顯的血流延遲。MCAO小鼠的主成分分析(PCA)顯示，右大腦半球的靜脈血管網(wǎng)(藍色) 較左大腦半球的靜脈血管網(wǎng)(藍色)更為豐富，且動脈血管(紅色)僅在完整的右大腦半球顯示(圖4j-l)。進一步對腦血流灌注進行量化發(fā)現(xiàn)，正常小鼠中，左右大腦半球中線性上升的熒光信號具有幾乎相同的斜率，表明相對灌注為∼1 (圖4m); 而在MCAO小鼠中，左半球的相對灌注僅為0.159 (圖4n)。與腦灌注不足的模型小鼠相比，MCAO組血液灌注顯著減少∼85% (圖4o)，利用熒光信號定量的方法與激光多普勒測量結(jié)果一致。因此，NIR-IIa動態(tài)熒光成像為血流測定提供一種新的方法。

圖4、小鼠腦血管的動態(tài)NIR IIa熒光成像。a–c，正常小鼠NIR IIa圖像。d–f，PCA重疊圖像顯示正常小鼠的動脈(紅色)和靜脈(藍色)血管。g–i，MCAO小鼠的NIR IIa圖像。j–l，PCA重疊圖像顯示MACO小鼠的動脈(紅色)和靜脈(藍色)血管。m、 n，正常小鼠(m)和MACO小鼠(n)左側(cè) (紅色)和右側(cè) (黑色)大腦半球的NIR-IIa信號隨時間的變化。o、采用NIR-II法(紅色)和激光多普勒血流頻譜(藍色)測定對照組(n=3)、MCAO組(n=4)和低血流灌注組(n=4)左大腦半球平均血流灌注。

參考文獻

?? ?? ??

紅外二區(qū)小動物活體熒光成像系統(tǒng) - MARS 

NIR-II in vivo imaging system 

高靈敏度 - 采用Princeton Instruments深制冷相機，活體穿透深度高于15mm

高分辨率 - 定制高分辨大光圈紅外鏡頭，空間分辨率優(yōu)于3um

熒光壽命 - 分辨率優(yōu)于 5us

高速采集 - 速度優(yōu)于1000fps （幀每秒）

多模態(tài)系統(tǒng) - 可擴展X射線輻照、熒光壽命、一區(qū)熒光成像、原位成像光譜，CT等

顯微鏡 - 紅外二區(qū)高分辨顯微系統(tǒng)，兼容成像型光譜儀

?? ?? ??

 恒光智影

       上海恒光智影醫(yī)療科技有限公司，專注于紅外二區(qū)成像技術。致力于為生物醫(yī)學、臨床前和臨床應用等相關領域的研究提供*的、一體化的成像解決方案。自主研發(fā)紅外二區(qū)小動物活體熒光成像系統(tǒng)-MARS。

       與基于可見光波長的傳統(tǒng)成像技術相比，我們的技術側(cè)重于X射線、紫外、紅外、短波紅外、太赫茲范圍，可為腫瘤學、神經(jīng)學、心血管、藥代動力學等一系列學科的科研人員提供清晰的成像效果，助力科技研發(fā)。

       同時，恒光智影還具備探針研發(fā)能力，我們已經(jīng)成功研發(fā)了超過15種探針，這些探針將廣泛地應用于眾多生物科技前沿領域的相關研究中。