G6P檢測(cè)試劑盒（WST-8法）

產(chǎn)品貨號(hào)：BA18003

產(chǎn)品規(guī)格：100次

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

尚寶的G6P檢測(cè)試劑盒(WST-8法) (G6P Assay Kit with WST-8)是一種高靈敏度的基于WST-8的顯色反應(yīng)，通過(guò)比色法來(lái)檢測(cè)細(xì)胞、組織或其它樣品中G6P含量的檢測(cè)試劑盒。 ?

WST-8是MTT的一種升級(jí)替代產(chǎn)品，和MTT或其他MTT類似產(chǎn)品如XTT、MTS等相比有明顯的優(yōu)點(diǎn)。首先，MTT被一些脫氫酶還原生成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶解液來(lái)溶解；而WST-8和XTT、MTS產(chǎn)生的formazan都是水溶性的，可以省去后續(xù)的溶解步驟。其次，WST-8產(chǎn)生的formazan比XTT和MTS產(chǎn)生的formazan更易溶解。再次，WST-8比XTT和MTS更加穩(wěn)定，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加穩(wěn)定。另外，WST-8和MTT、XTT等相比，線性范圍更寬，靈敏度更高。WST-8和WST-1相比，檢測(cè)靈敏度更高，更易溶解，并且更加穩(wěn)定。 ?

本試劑盒使用便捷。使用細(xì)胞、組織等的裂解液即可進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)需分離純化細(xì)胞、組織或其它樣品中的G6P。 ? 本試劑盒檢測(cè)靈敏度高，線性范圍寬?？梢詸z測(cè)含量低至20μM (1nmol)的G6P，在20μM (1nmol)至500μM (25nmol)之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。 ?

G6P (Glucose-6-phosphate，葡萄糖-6-磷酸，又稱6-磷酸葡萄糖)是葡萄糖的第6位碳上的羥基在己糖激酶催化下發(fā)生磷酸化后生成的分子，是細(xì)胞中常見(jiàn)的糖代謝小分子，參與糖酵解(glycolytic pathway)和磷酸戊糖(pentose phosphate pathway)等生化途徑。在糖酵解的第一步反應(yīng)中，葡萄糖被己糖激酶催化生成葡萄糖-6-磷酸，然后通過(guò)磷酸葡萄糖異構(gòu)酶的催化形成果糖-6-磷酸，以繼續(xù)糖酵解的其它步驟；而在戊糖磷酸途徑中，葡萄糖-6-磷酸是其第一個(gè)底物，該過(guò)程也是生成NADPH的主要途徑。除了這兩個(gè)代謝途徑外，葡萄糖-6-磷酸也能轉(zhuǎn)化形成糖原或淀粉而被存儲(chǔ)起來(lái)。 ?

本試劑盒可檢測(cè)樣品中的G6P含量，具體原理如下：葡萄糖-6-磷酸(G6P)在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH)的作用下氧化生成6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯(6-phosphogluconate, 6-PG)，在這一反應(yīng)中NADP+ 被還原為NADPH，生成的NADPH在電子耦合試劑1-mPMS (1-Methoxy-5-methylphenazinium Methyl Sulfate)的作用下將WST-8還生成橙黃色的formazan，在450nm左右有最大吸收峰。反應(yīng)體系中生成的formazan與樣品中總的G6P的量呈正比關(guān)系。 WST-8法檢測(cè)G6P的原理參考圖1。

本試劑盒適用于檢測(cè)細(xì)胞、組織以及其它適當(dāng)樣品中G6P的含量。 ?

本試劑盒可以測(cè)定100個(gè)樣品。

產(chǎn)品組成：

使用說(shuō)明：

1. 樣品的準(zhǔn)備：

a. G6P提取液室溫或37oC水浴解凍，解凍后置于冰浴。如果37℃水浴解凍，須注意解凍后立即置于冰浴。

b. 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：對(duì)于貼壁細(xì)胞，約1×10⁶個(gè)細(xì)胞(大約相當(dāng)于6孔板一個(gè)孔長(zhǎng)滿的細(xì)胞數(shù)量)，吸凈培養(yǎng)液，用移液器加入200μl的冰浴預(yù)冷的G6P提取液，并輕輕吹打，以促進(jìn)細(xì)胞的裂解；對(duì)于懸浮細(xì)胞，收集約1×10⁶個(gè)細(xì)胞，600g離心5分鐘，吸凈培養(yǎng)液，用移液器加入200μl冰浴預(yù)冷的G6P提取液，并輕輕吹打，以促進(jìn)細(xì)胞的裂解。裂解過(guò)程宜盡量在冰上操作。隨后12,000g，4℃離心5-10分鐘，取上清作為待測(cè)樣品，冰浴存放備用。

c. 組織樣品的準(zhǔn)備：冰浴預(yù)冷的PBS洗滌組織后，稱取約10-50mg的組織樣品，用剪刀剪碎，置于勻漿器中，加入400μl的冰浴預(yù)冷的G6P提取液在冰上或室溫進(jìn)行勻漿。隨后12,000g，4oC離心5-10分鐘，取上清作為待測(cè)樣品，冰浴存放備用。注：勻漿過(guò)程在冰上或室溫操作均可，但以冰浴操作為佳，可以有效減少內(nèi)源性G6P水平的下降。

d. 液體樣品可以直接進(jìn)行檢測(cè)。

注意：如果樣品中存在能轉(zhuǎn)變或消耗G6P的酶，在檢測(cè)前需使用10kDa超濾管去掉蛋白質(zhì)以避免酶的影響。

2. 試劑盒的準(zhǔn)備工作：

a. G6P標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：把10mM的G6P標(biāo)準(zhǔn)品用G6P提取液稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛忍荻?。如初次檢測(cè)可以設(shè)置0、31.25、62.5、125、250、500μM這幾個(gè)濃度，檢測(cè)時(shí)96孔板每孔加入50μl的標(biāo)準(zhǔn)品，相當(dāng)于每孔加入的G6P的量為0、1.56、3.125、6.25、12.5、25nmol。如有必要，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中可以根據(jù)樣品中的G6P含量對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度范圍進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。其中濃度為0μM的點(diǎn)為空白對(duì)照點(diǎn)(Blank)，僅含G6P提取液。

b. G6P檢測(cè)液的配制：樣品中的NADPH等可能會(huì)產(chǎn)生一定的背景，建議設(shè)置加入樣品而不加入酶混合液的背景對(duì)照；對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的G6P檢測(cè)液，需要加入酶混合液。每個(gè)背景對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)品或樣品的檢測(cè)需要使用50μl的G6P檢測(cè)液，請(qǐng)根據(jù)所需檢測(cè)的背景對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的數(shù)量，配制適量的G6P檢測(cè)液，并注意現(xiàn)配現(xiàn)用。G6P檢測(cè)液的配制方法如下：

3. 樣品測(cè)定：

a. 樣品中G6P含量的測(cè)定：吸取50μl待測(cè)樣品至96孔板中，為了減少實(shí)驗(yàn)建議設(shè)置樣品的重復(fù)孔。后續(xù)如果發(fā)現(xiàn)樣品中的G6P含量過(guò)高，超出標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍，則需要用G6P提取液將樣品適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行檢測(cè)；含量過(guò)低時(shí)則需要 加大細(xì)胞或組織樣品的用量。

b. 每孔加入50μl G6P檢測(cè)液，用移液槍輕輕吹打均勻。在加入G6P檢測(cè)液的過(guò)程中須輕柔操作，以免產(chǎn)生氣泡。若不慎出現(xiàn)氣泡，可使用細(xì)小的吸頭或針頭戳破。背景對(duì)照孔需要加入50μl不含G6P底物的G6P檢測(cè)工作液。特別注意：如果樣品中的NADPH等產(chǎn)生的背景比較高，就必須設(shè)置背景對(duì)照；初次檢測(cè)宜設(shè)置背景對(duì)照。

c. 37℃避光孵育10分鐘，此時(shí)會(huì)形成橙黃色的formazan。測(cè)量450nm處的吸光度，如果顯色較淺，也可以適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間至15-30分鐘，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)顯色會(huì)越來(lái)越深。

4. 樣品中G6P含量的計(jì)算：

a. 將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的吸光度減去標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0μM的空白對(duì)照(Blank)吸光度。同時(shí)，如果背景對(duì)照(Background)的吸光度比較高，需要再將所有樣品的吸光度減去各自的背景對(duì)照的吸光度。

b. 以G6P濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。G6P標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)效果請(qǐng)參考圖2。

圖2. 本試劑盒檢測(cè)G6P的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖中的反應(yīng)時(shí)間為30分鐘。不同的檢測(cè)條件下，實(shí)際讀數(shù)會(huì)因標(biāo)準(zhǔn)品的配制、檢測(cè)儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。

c. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞、組織等樣品中的G6P濃度。

備注：根據(jù)檢測(cè)得到的濃度及樣品的體積，即可計(jì)算出G6P的量。

d. 如果希望更加精確地來(lái)表述G6P的量，可以將樣品用BCA法測(cè)定蛋白濃度。最終用單位蛋白量中G6P的量來(lái)比較精確地進(jìn)行表述。

注意事項(xiàng)：

1. 經(jīng)檢測(cè)本試劑盒中的酶混合液室溫存放72小時(shí)或反復(fù)凍融5次不影響其酶活性。 ?

2. 由于G6P提取液略顯粘稠，以該提取液作為稀釋液時(shí)，無(wú)論對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品還是樣品進(jìn)行稀釋，在稀釋過(guò)程中務(wù)必確保稀釋均勻，否則易造成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)產(chǎn)生較大波動(dòng)。 ?

3. 在樣品加樣和混勻過(guò)程中，須盡量避免產(chǎn)生氣泡，以免影響最終的吸光度測(cè)定。 ?

4. 如果不能非常嚴(yán)格地控制反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間，每次檢測(cè)都需要設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線。 ?

5. 如果樣品溶液中G6P濃度過(guò)高或過(guò)低，不在試劑盒的線性檢測(cè)范圍內(nèi)時(shí)，可適當(dāng)調(diào)整樣品或者提取液的用量。 ?

6. 盡量使用新鮮樣品進(jìn)行檢測(cè)，凍存或反復(fù)凍融的細(xì)胞或組織樣品可能對(duì)結(jié)果有一定影響。 ?

7. 本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

8. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

保存條件：-20oC保存，一年有效。顯色液須-20oC避光保存。