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類器官 Mouse Intestinal Organoid Kit類器官（Organoids）是指將成體干細胞或多能干細胞在體外三維培養(yǎng)形成的具有一定空間結構的組織類似物。類器官在組織結構、細胞類型、自我更新能力和功能等方面與來源組織高度一致，從而在發(fā)育生物學、疾病造模、精準醫(yī)學、藥物研發(fā)、基因和細胞療法、感染和免疫以及再生醫(yī)學等生物醫(yī)學的多個領域展現(xiàn)出*的優(yōu)勢。

產品介紹

bioGenous^TMMouse Intestinal Organoid Kit（小鼠小腸類器官試劑盒）是一款用于建立和維持小鼠腸道成體干細胞來源小腸類器官的*培養(yǎng)基。生長在該*培養(yǎng)基中的小鼠小腸類器官主要由干細胞、腸祖細胞和腸絨毛細胞、潘氏細胞、杯狀細胞和少量腸內分泌細胞組成，在自我更新能力、組織結構、細胞類型和功能方面，小鼠小腸類器官重現(xiàn)了體內小腸上皮的特征，因此是腸道穩(wěn)態(tài)和疾病機制研究的理想體外模型。

技術參數(shù)產品信息:

小鼠小腸類器官*培養(yǎng)基的制備：
使用無菌操作技術配制小鼠小腸類器官*培養(yǎng)基。以下是準備10mL*培養(yǎng)基的示例，如所需量不同，可相應調整用量。

1.       冰上解凍Mouse Intestinal Organoid Supplement B (50x)和Mouse Intestinal Organoid Supplement C (250x)。
注意：解凍后，建議將Mouse Intestinal Organoid Supplement B (50x)和Mouse Intestinal Organoid Supplement C (250x) 分別分裝后保存取用，避免反復凍融。
2.       將200uL Mouse Intestinal Organoid Supplement B (50x)，40uL Mouse Intestinal Organoid Supplement C (250x)加至9.76mLMouse Intestinal Organoid Basal Medium中，充分混合，配制成10mL小鼠小腸類器官*培養(yǎng)基。
注意：配制后的小鼠小腸類器官*培養(yǎng)基可在2-8°C儲存，建議在兩周內使用。Mouse Intestinal Organoid Supplement B(50x)內含有細菌及真菌抗生素(50x)。
小鼠小腸類器官原代培養(yǎng)
1.       依據(jù)所在單位批準的實驗動物倫理及操作規(guī)范犧牲小鼠。
2.       準備若干培養(yǎng)皿，加入4℃預冷的DPBS備用。
3.       標準手術操作取小鼠小腸，根據(jù)實驗需求取總長度約3厘米至20厘米的小腸段，置于含DPBS的培養(yǎng)皿中。
4.       使用移液管或者注射器往小腸一端注入DPBS以沖洗腸內容物，沖洗后置于新的含DPBS的培養(yǎng)皿中，重復沖洗數(shù)次至內容物*被沖洗干凈，置于新的含DPBS的培養(yǎng)皿中。
5.       使用手術-剪將腸管剪開，腸腔面朝上，一只手使用手術-鑷夾住腸組織一端，另一只手使用手術-刀片輕輕刮去腸腔表面腸絨毛，待腸絨毛被刮凈后，將腸組織置于新的含DPBS的培養(yǎng)皿中清洗，重復清洗一次。
6.       將清洗后的小腸組織全部剪碎至2mm寬，并轉移至含有5mmol/L EDTA的預冷DPBS中消化，置于4℃孵育30min。
7.       消化完成后，將組織碎片轉移到新的含DPBS的培養(yǎng)皿中清洗，重復一次以去除EDTA。
8.       用5mL移液管在含冷的DPBS的培養(yǎng)皿或50mL離心管中吹打、重懸組織碎片，使組織反復穿過移液管尖以產生機械剪切力從而使隱窩與基底層分離，取一部分懸液鏡檢，當可以看到大量的隱窩樣結構后，停止吹打，并對吹打后的組織懸液進行70μm濾網(wǎng)過濾。
9.       收集穿過濾網(wǎng)的組織懸液，150g離心力4℃離心3min。
10.    棄上清，使用1mLDPBS重懸組織沉淀，取20uL懸液進行鏡檢和隱窩計數(shù)，計數(shù)完成后吸取包含所需隱窩量的懸液，150g離心力4℃離心3min，棄上清后置于冰上。
11.    用適量的 Matrigel重懸組織沉淀，推薦重懸密度為每10uL Matrigel懸液包含200至600個隱窩，重懸后置于冰上，重懸時間不超過30s以避免Matrigel過早凝固。
注意： Matrigel 稀釋比例應在70%以上以保證培養(yǎng)過程中Matrigel的結構穩(wěn)定性。
12.    將Matrigel和組織細胞的混合懸液點入24孔板底部正中央，每孔30uL左右，避免懸液接觸孔板側壁。
注意：為防止Matrigel室溫凝固，此步驟應盡快完成。
13.    將接種完成后的培養(yǎng)板至于37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育15min左右待Matrigel凝固。
14.    配制小鼠小腸類器官*培養(yǎng)基。
15.    待Matrigel*凝固后，加入已配制好的小鼠小腸類器官*培養(yǎng)基，24孔板每孔500uL。
注意：請沿壁緩慢加入，避免破壞已凝固結構。
16.    將24孔板置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
17.    每 3 天更換一次培養(yǎng)基，更換培養(yǎng)基時應避免破壞Matrigel。
18.    密切監(jiān)測類器官生長狀態(tài)，理想情況下，小鼠小腸類器官應在5至7天內建成。
小鼠小腸類器官傳代培養(yǎng)
19.    用經(jīng)過Anti-Adherence Rinsing Kit (E238002)潤洗的槍頭吹打刮取類器官，并將類器官和培養(yǎng)基的懸液轉移至經(jīng)過Anti-Adherence Rinsing Kit潤洗的1.5mL EP管中。
20.    用經(jīng)過Anti-Adherence Rinsing Kit潤洗的槍頭用力重懸類器官懸浮液，使得類器官與Matrigel分離。
21.    150g離心力4℃離心3min，棄上清，使用DPBS重懸底部類器官沉淀，150g離心力4℃再次離心3min，棄上清后置于冰上。
22.    用適量的 Matrigel重懸類器官沉淀，重懸后置于冰上，重懸時間不超過30s以避免Matrigel過早凝固。
注意： Matrigel 稀釋比例應在70%以上以保證培養(yǎng)過程中Matrigel的結構穩(wěn)定性。
23.    將Matrigel和類器官的混合懸液點入24孔板底部正中央，避免懸液接觸孔板側壁，每孔30uL左右。
注意：為防止Matrigel室溫凝固，此步驟應盡快完成。
24.    將接種完成后的培養(yǎng)板至于37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育15min左右待Matrigel凝固。
25.    配制小鼠小腸類器官*培養(yǎng)基。
26.    待Matrigel*凝固后，加入已配制好的小鼠小腸類器官*培養(yǎng)基，24孔板每孔500uL。
27.    將24孔板置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

類器官 Mouse Intestinal Organoid Kit