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NC膜的選擇、注意事項及應(yīng)用技巧
閱讀：4997 發(fā)布時間：2020-7-23酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane，簡稱NC膜)，是蛋白印跡廣泛使用的轉(zhuǎn)移介質(zhì)，對蛋白有很強的結(jié)合能力，而且適用于各種顯色方法，包括同位素，化學(xué)發(fā)光（Luminol類）、常規(guī)顯色、染色和熒光顯色；背景低，信噪比高。在膠體金試紙中用做C/T線的承載體，同時也是免疫反應(yīng)的發(fā)生處。NC膜是生物學(xué)試驗中重要的耗材之一。
硝酸纖維素NC膜的使用很簡便，比如不需要甲醛預(yù)處理，只要在去離子水面浸潤排出膜內(nèi)氣泡，再在電泳緩沖液中平衡幾分鐘就可以了；硝酸纖維素 NC膜很容易封閉，也不需要特別嚴謹?shù)那逑礂l件。轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素NC膜上的蛋白在合適的條件下可以穩(wěn)定保存很長時間，不過要注意的是純的硝纖膜在比較脆，又容易卷，操作要小心，不適合用于需要多次重復(fù)清洗的用途，因為經(jīng)不起多次“折磨”。
選擇硝纖NC膜時要注意的是選擇合適的孔徑，通常20KD以上的大分子蛋白用0.45um孔徑的膜，小于20KD的話建議選擇0.2um的，如果小于7KD的話選擇0.1um的膜。另外還要注意選擇純的NC膜?；煊泻姿崂w維（CM）的NC膜結(jié)合力會有所降低。
另外，由于NC膜上結(jié)合的蛋白會因為一些去污劑而被代替，因此在封閉時使用較溫和的Tween20，而且濃度不要超過0.3%（據(jù)說0.05%效果）。一般而言，NC膜越純，其蛋白結(jié)合能力就越高，所以要增加WB的靈敏度和分辨率，提高所使用膜的純度是個可以考慮的選擇。如果NC膜攙雜一些醋化纖維素，會影響蛋白質(zhì)結(jié)合。ADVANTEC生產(chǎn)的硝酸纖維素濾膜由于是純NC膜，比較脆，需要小心操作。
注意事項：
1．由于硝酸纖維素膜是親水膜，故不需要在乙醇、甲醇等溶液中浸泡活化。
2．硝酸纖維素膜比較脆，容易破碎，操作要小心。
3．本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
4．為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
NC膜的應(yīng)用技巧：
1. 蛋白與膜的結(jié)合原理
蛋白與膜的結(jié)合原理， 已知的結(jié)合力包括疏水作用力\H鍵\靜電作用力等，確切的結(jié)合原理并不明確，主要靠假說來支撐。主要有兩種假說：
1）首先兩者靠靜電作用力結(jié)合，然后靠H鍵和疏水作用來維持長時間結(jié)合。
2）首先兩者靠疏水作用結(jié)合，然后靠靜電作用來維持長時間結(jié)合。
兩條假說，都表明其結(jié)合過程分為兩步，首先結(jié)合和后面長時間結(jié)合。由于結(jié)合原理的不明確性，導(dǎo)致在這方面的工作非常依賴實踐經(jīng)驗。
2. 膜對結(jié)合的影響
1）膜孔徑
有些技術(shù)人員傾向使用膜孔徑來區(qū)分不同的膜，但是請注意這只僅僅限于同一廠家的產(chǎn)品，如果是不同廠家的產(chǎn)品，這種比較是無意義的。膜孔徑與層析速度的關(guān)系，已在上文描述。隨著膜孔徑減小，膜的實際可用表面積遞增，膜結(jié)合蛋白的量也遞增. 估量表面積的參數(shù)為表面積比率（實際可用表面積與所用膜平面積的比率）。另外，膜孔徑越小，層析速度也越小，那么金標復(fù)合物通過T線的時間也就越長，反應(yīng)也就越充分。
綜合以上兩點，結(jié)論為膜孔徑越小靈敏度越高。但是同時也減慢了跑板速度，增加了非特異性結(jié)合的機會，也就是假陽性越高.所以要按照試驗結(jié)果挑選適合實際項目的膜，找到合適的平衡點。
2）不同廠家的膜差異
這個差異主要來源于兩點：
1> 生產(chǎn)膜時，使用的聚合物和表面活性劑的來源，類型，數(shù)量不同。同理，在膜處理中這兩類物質(zhì)一般會對性能產(chǎn)生較大影響。 2> 處理過程不同。
3. 生物原料，緩沖溶液的試劑和配方
1）生物原料， 作為CT線的生物原料使用情況各異，所以這里只做略述。
首先，單克隆抗體與膜的結(jié)合優(yōu)于多克隆抗體，主要時由于多克隆抗體有很多不同的表面位點，而各位點與膜的結(jié)合條件都有細微的差別，毫無疑問就增加了優(yōu)化難度。其次，分子量越大，蛋白越難結(jié)合到固相材料上。
2）緩沖液
大家關(guān)心的可能就是希望獲得一個性能優(yōu)良的配方，包括緩沖液，封閉液等等處理溶液配方。緩沖液的構(gòu)成一般是：PBS（或其他緩沖體系）+作用物質(zhì)（針對某一特定問題）+PH調(diào)整. 參考過以前的各種資料后，個人意見為配方原則為宜簡不宜繁，根據(jù)自己的需要添加作用物質(zhì)，原來的很多需要添加的作用物質(zhì)，由于膜制造技術(shù)的改進已經(jīng)不再需要。推薦的緩沖體系為0.01M PBS PH7-7.2， 該緩沖體系對多種抗原抗體都有良好的適應(yīng)性。
作用物質(zhì)的情況大致羅列如下：
少量NACL，減少信號強度，消假陽。
有機醇（甲醇，異丙醇等），潤濕膜，減少膜帶有的靜電，利于結(jié)合包被。個人不推薦，因制膜工藝改進。
表面活性劑（TW20，TX100），增加親水力，可避免線條中空現(xiàn)象，也可增色。
糖，保護劑，減緩老化速度，也可以增加親水力同上。
調(diào)PH到某個位置，可以消假陽。
4. 點樣環(huán)境
環(huán)境濕度對點膜過程非常重要。濕度一般在45-65%。濕度過低，膜上容易聚集靜電荷，點膜容易出現(xiàn)散點，導(dǎo)致測試會出現(xiàn)疏水斑。濕度過高，膜上毛細作用加強，點膜容易引起CT線變寬甚至擴散。為了保證點樣時膜濕度的均一性，一般在點樣前把膜放到該濕度條件下平衡一段時間。
5. 點樣儀器與膜面情況的關(guān)系
有兩種點樣方式，劃膜式和非接觸點膜式、非接觸點膜式優(yōu)于劃膜式，進口劃膜式優(yōu)于國產(chǎn)劃膜式。
因劃膜式為軟管將抗體劃到膜表面，而膜本身的物理性質(zhì)為軟脆，劃管會在其表面留下印痕.進口的劃膜機由于使用的材料和控制系統(tǒng)較好，所以留下的劃痕較輕，而國產(chǎn)儀器較差，留下的劃痕也就比較嚴重。 劃痕容易對層析的金標復(fù)合物形成阻力，導(dǎo)致假陽性。 同時容易出現(xiàn)跑板時在T線位置出現(xiàn)若有若無一條細線（鬼線），而跑板結(jié)束后鬼線消失的奇怪現(xiàn)象。
6. 膜的寬度與點樣位置
膜的寬度一般有18mm（or 20mm）和25mm兩種， 分別使用在做測試條和做測試板上。然而，不同的T線點樣位置將帶來不同的靈敏度。點樣位置上移，金標復(fù)合物通過T線位置時速度變慢，反應(yīng)時間增加，靈敏度升高。反之靈敏度降低。這個方法可以用來改變靈敏度和消除假陽性。
7. 溶液在膜上的擴散
溶液在膜上的點樣量一般情況下為1ml/cm。溶液在膜上的擴散是趨向兩端的，噴點上去的是均勻的抗體溶液，但當干燥時線條邊緣的干燥速度高于中間，中間的抗體會不斷向兩邊擴散，所以干燥后抗體是向線條的兩端聚集的。一般情況下不影響你的試驗。如果你發(fā)現(xiàn)線條出現(xiàn)兩端紅，中間淡的現(xiàn)象，就要考慮這個問題了?？梢约尤缟厦嬲f的作用物質(zhì)來解決。
8. 點膜前后的封閉作用
從供應(yīng)商處購買回的膜基本上都是已經(jīng)優(yōu)化處理好的，直接點膜就可使用.然而我們還是經(jīng)常會遇到關(guān)于封閉的討論。其實封閉不象大家認為的那樣，一封閉什么問題都解決了. 老問題走了新問題又來了，而且更麻煩，我要說的是慎用封閉。我極其反對點膜前封閉的做法。原因為廠家在生產(chǎn)膜時候，各種配方是混合加入原漿的。而點膜前封閉時要將膜浸泡在封閉液內(nèi)，必然擾亂了膜內(nèi)正常的物質(zhì)分布。由此引發(fā)了許多問題，也降低了工作效率。也有廠家遇到不封閉就無法包被上膜的問題，其實可以通過其他辦法來解決，封閉必然是下測。
經(jīng)常使用的封閉手法有兩種：流動封閉，將作用物質(zhì)處理在樣品墊上。膜上定點封閉，將作用物質(zhì)配成溶液噴點在膜的特定位置上。該方法需要使用BIODOT的AIRJET噴頭，可以將不合格的半成品大板重新復(fù)活。只要是將封閉做在了膜上，就必然會對產(chǎn)品的穩(wěn)定性造成影響，具體的影響程度要通過穩(wěn)定性測試來評判。
9. 膜的儲存
剛生產(chǎn)出的膜一般含有5-10%的水分。關(guān)于膜的老化機理，有個理論支持，不過爭議比較大。理論認為：膜的老化是因為膜上的水分蒸發(fā)，使膜變得疏水，帶電荷并變脆。儲存膜一般要求是避光，密封，過干或過濕都不利。在這種保存條件下，一般可以放置兩年。但是如果膜上做了封閉處理，就要根據(jù)具體試驗情況來判斷了。有些膜由于生產(chǎn)工藝的問題，使用后靈敏度會在一段時間內(nèi)發(fā)生變化，遇到這種問題，就需要在點膜后放置一段時間，待穩(wěn)定后方可進入調(diào)試生產(chǎn)。
