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蛋白酶降解靶向嵌合物（PROTACs）是一類異雙功能分子，目前正在實(shí)現(xiàn)其作為靶向蛋白質(zhì)降解的治療策略的潛力。然而，現(xiàn)有設(shè)計(jì)的缺陷是缺乏對(duì)蛋白質(zhì)降解有效載荷的細(xì)胞選擇性靶向。本文報(bào)道了Burley團(tuán)隊(duì)發(fā)表的一篇關(guān)于HER2+細(xì)胞系中受體相互作用絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶2（RIPK2）的細(xì)胞靶向降解方法，實(shí)現(xiàn)PROTAC骨架的細(xì)胞選擇性傳遞的潛力。

蛋白水解靶向嵌合體（PROTACs）是一種異雙功能分子，可以選擇性地降解目標(biāo)蛋白（POI）。[1,2]PROTACs的作用機(jī)制（MoA）是POI和E3連接酶形成三元復(fù)合物，然后給靶蛋白打上泛素化的標(biāo)簽，隨后通過(guò)泛素?蛋白酶體途徑降解。[3,4]這些蛋白質(zhì)降解劑的一個(gè)特點(diǎn)是其降解過(guò)程具有催化性質(zhì)，使得PROTAC從三元復(fù)合物解離后能夠再循環(huán)利用。這種作用機(jī)制相較于傳統(tǒng)的非共價(jià)抑制具有更持久的藥理效應(yīng)，在體內(nèi)使用劑量較低。[5?9]與傳統(tǒng)的抑制劑策略相比，PROTACs的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是最終需要與POI結(jié)合并進(jìn)行降解，而不是通過(guò)與小分子的化學(xué)計(jì)量相互作用來(lái)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能。[10]

目前，PROTACs應(yīng)用的一個(gè)主要缺陷是缺乏細(xì)胞選擇性和可變的細(xì)胞滲透性，[11]這反映在其次優(yōu)的藥代動(dòng)力學(xué)特性上。[12,13]細(xì)胞靶向模塊融入PROTAC設(shè)計(jì)中，可以將PROTAC載荷輸送到所需的細(xì)胞類型，并降低脫靶毒性（Figure1A）。

一種新興的細(xì)胞選擇性遞送PROTACs平臺(tái)是將其與抗體（Ab）結(jié)合。[14]抗體藥物偶聯(lián)物（ADCs）選擇性地將分子載荷（如PROTAC）傳遞到特定的細(xì)胞類型，從而避免了對(duì)PROTAC骨架的細(xì)胞攝取進(jìn)行大量?jī)?yōu)化的需求（Figure1B）。雖然已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了Ab-PROTAC用于細(xì)胞選擇性降解BRD4和ERα的研究，[15?17]但連接化學(xué)（可裂解vs不可裂解）、藥物在目標(biāo)細(xì)胞中的積累以及通過(guò)Ab結(jié)合可靶向多樣的POI的影響仍處于起步階段。在這里，作者擴(kuò)展了Ab-PROTAC結(jié)合物的范圍，并展示了在HER2+細(xì)胞系中對(duì)絲氨酸和蘇氨酸蛋白激酶2（RIPK2）的細(xì)胞選擇性和靶向性降解（Figure1C）。

作者通過(guò)二硫化物重連試劑（二溴吡嘧啶二酮，diBrPD），將RIPK2 PROTAC分別與抗HER2單克隆抗體（mAb），曲妥珠單抗,和抗IL-4帕索利珠單抗（陰性對(duì)照）偶聯(lián)起來(lái)，分別得到了ADC-2和ADC-3。在SKOV3 HER2+卵巢癌細(xì)胞系中評(píng)估了使用ADC-2和ADC-3對(duì)RIPK2的降解作用。與原始PROTAC相比，抗HER2的ADC-2顯示出類似的RIPK2降解水平，而抗IL-4的ADC-3在10nM濃度下沒(méi)有發(fā)生降解。意外發(fā)現(xiàn)是，在100nM以上的濃度下使用ADC-3進(jìn)行RIPK2降解（Figure3A）。由于SKOV3細(xì)胞沒(méi)有膜結(jié)合的IL-4，觀察到的降解可能是由于非特異性攝取機(jī)制，可能是巨噬細(xì)胞吞噬作用所致。[18]

為了證實(shí)RIPK2降解是通過(guò)泛素?蛋白酶體途徑發(fā)生的，作者在SKOV3細(xì)胞中加入已知的蛋白酶體抑制劑MG132（濃度為10μM），然后用PROTAC 1、ADC-2或ADC-3處理細(xì)胞，沒(méi)有觀察到任何化合物的降解，這證實(shí)了降解是通過(guò)蛋白酶體依賴的途徑發(fā)生的（Figure3C）。在ADC-1和ADC-2在1μM范圍內(nèi)均未觀察到細(xì)胞毒性（Figure3D），也排除連接子的不穩(wěn)定性導(dǎo)致PROTAC的過(guò)早釋放。

然后在HEK293 HER2-細(xì)胞系中使用HiBiT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ADC-2和ADC-3的細(xì)胞選擇性靶向性。這兩個(gè)ADC-2和ADC-3在較高濃度下表現(xiàn)出RIPK2的降解，當(dāng)濃度超過(guò)100nM時(shí)，降解效果更為顯著。

這與在SKOV3細(xì)胞中觀察到的類似降解可能是由于非特異性細(xì)胞攝取的事實(shí)相一致。重要的是，與使用PROTAC 1時(shí)降解50%相比，兩種偶聯(lián)物在10nM時(shí)均未觀察到降解（Figure 4A）。同樣，所有化合物均未觀察到細(xì)胞毒性（Figure 4B）。

總之，作者通過(guò)使用Ab-PROTAC偶聯(lián)物，在HER2+SKOV3細(xì)胞中展示了對(duì)RIPK2的細(xì)胞選擇性降解。這種方法補(bǔ)充了ADC的發(fā)展，并且為使用具有次優(yōu)物理化學(xué)性質(zhì)的PROTAC或需要在特定細(xì)胞中選擇性傳遞PROTAC載荷的情況下提供了設(shè)計(jì)策略，為藥物開(kāi)發(fā)和治療提供了新的可能性。

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