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雄甾烯酮；雄烯酮（ADT）定量檢測試劑盒（ELISA）
閱讀：29 發(fā)布時(shí)間：2024-11-25僅供科研使用，不得用于臨床診斷
雄甾烯酮；雄烯酮（ADT）定量檢測試劑盒（ELISA）
定量檢測血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液中雄甾烯酮；雄烯酮（ADT）的濃度。
使用試劑盒前，必須仔細(xì)閱讀本說明書。
實(shí)驗(yàn)原理
本試劑盒采用競爭法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。在預(yù)包被抗雄甾烯酮；雄烯酮（ADT）抗體（固相抗體）的微孔酶標(biāo)板中，加入雄甾烯酮；雄烯酮（ADT）校準(zhǔn)品和待測樣本，再加入HRP標(biāo)記的雄甾烯酮；雄烯酮（ADT）抗原（酶標(biāo)抗原），經(jīng)過溫育與充分洗滌，去除未結(jié)合的組分，在微孔板固相表面形成固相抗體-酶標(biāo)抗原的免疫復(fù)合物。加底物A和B，底物在HRP催化下，產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，在終止液（2M 硫酸）作用下，最終轉(zhuǎn)化為黃色，在酶標(biāo)儀450nm波長上測定吸光度（OD值），吸光度（OD值）與待測樣品中雄甾烯酮；雄烯酮（ADT）的濃度負(fù)相關(guān)。擬合校準(zhǔn)品曲線，可以計(jì)算出樣本中雄甾烯酮；雄烯酮（ADT）的濃度。
試劑盒限制性
1、 僅供科研使用，不得用于臨床診斷。
2、 在試劑盒標(biāo)示的有效期內(nèi)使用，過期產(chǎn)品不得使用。
3、 跟其他廠家的試劑盒或者組分不能混用。
4、 使用試劑盒配套的樣品稀釋液。
5、 如果樣本值高于最高標(biāo)準(zhǔn)品濃度值，請將樣本適當(dāng)稀釋后，再重新測定。
6、 待測樣本中存在的人抗鼠等異嗜抗體會干擾檢測結(jié)果，檢測前，請排出該因素。
7、 通過其他方法得到的檢測結(jié)果，與本試劑盒測定結(jié)果不具有直接的可比性。
技術(shù)提示
1、 混合蛋白溶液時(shí)，避免起泡。
2、 加校準(zhǔn)品與樣本時(shí)，每個(gè)校準(zhǔn)品濃度和樣本都要更換移液槍頭，公共組分應(yīng)該懸臂加樣，避免交叉污染。
3、 合適的溫育時(shí)間，和充分的洗滌步驟，是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的必要條件。
4、 使用自動洗板機(jī)時(shí)，加入一個(gè)30秒浸泡的步驟，可以提高檢測精度。
5、 底物溶液為無色液體，保存過程中變?yōu)樗{(lán)色，代表底物溶液已經(jīng)失效，不得使用。
6、 終止液加樣順序與底物溶液加樣順序一致，加入終止液后，藍(lán)色底物產(chǎn)物，會瞬間變?yōu)辄S色。
7、 實(shí)驗(yàn)中，用剩的板條，應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。
8、 所有液體組分，使用前充分搖勻，嚴(yán)格按照說明書標(biāo)明的時(shí)間、加樣量及加樣順序進(jìn)行溫育操作。
試劑盒組分與保存
未開封的試劑盒保存在2-8度，不得使用過期試劑盒。
組分 | 數(shù)量 | 主要成分 | 開封后儲存 |
校準(zhǔn)品 | 0.3ml/管 | -- | 2-8℃14天 |
包被微孔板 | 96T/48T | 預(yù)包被固相抗體 | 2-8℃14天 |
HRP標(biāo)記抗原 | 10mL | HRP標(biāo)記的檢測抗原 | 2-8℃180天 |
底物液A | 6mL | 0.01%過氧化氫 | 2-8℃180天 |
底物液B | 6mL | 0.1%TMB | 2-8℃180天 |
終止液 | 6mL | 2mol/L稀硫酸 | 2-8℃180天 |
樣本稀釋液 | 6mL | PBS | 2-8℃180天 |
20×濃縮洗滌液 | 25mL | 0.05%Tween20 | 2-8℃180天 |
說明書 | 1份 | -- | -- |
自封袋 | 1個(gè) | -- | -- |
不干膠 | 2片 | -- | -- |
標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：20、10、5、2.5、1.25、0 ng/mL.
其他用品
1、 酶標(biāo)儀（450nm）
2、 精密移液器及一次性吸頭
3、 蒸餾水
4、 洗瓶或者自動洗板機(jī)
5、 37℃水浴鍋或恒溫箱
6、 500ml量筒
生物安全
1、 檢測必須符合實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范的規(guī)定，嚴(yán)格防止交叉污染，所有樣品、洗棄液和各種廢棄物都應(yīng)按照傳染物進(jìn)行處置。
2、 試劑盒的液體組分中，含有proclin-300防腐劑，可能引起皮膚過敏反應(yīng)，避免吸入煙霧與皮膚接觸。
3、 底物液對皮膚、眼睛和上呼吸道有刺激作用，避免吸入煙霧。
4、 戴上防護(hù)手套，實(shí)驗(yàn)完成后洗手。
樣品的采集和儲存
以下只是列出樣品采集和保存的一般指南。所有樣本采集保存過程中，不得使用疊氮鈉做為防腐劑。
1、 細(xì)胞培養(yǎng)上清：4000rpm條件下離心20min，去除細(xì)胞顆粒和聚合物，上清液保存在- 20℃以下，避免反復(fù)凍融。
2、 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，4000rpm條件下離心20min，小心地分離出血清，保存在-20℃以下，避免反復(fù)凍融。
3、 血漿：肝素，EDTA，或檸檬酸鈉作為抗凝劑。在4000rpm條件下，離心20分鐘取上清，血漿保存在-20℃以下，避免反復(fù)凍融。
樣本收集后，無法一次檢測完畢，請按一次用量分裝凍存，避免反復(fù)凍融，使用時(shí)在室溫下解凍，確保樣品均勻充分解凍。
4、 組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01 M,pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液，稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS(一般按1: 9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)9 mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中，在冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對勻漿液進(jìn)行超聲破碎或反復(fù)凍融。最后將勻漿液5000×g離心 5-10分鐘，取上清檢測。
5、 細(xì)胞提取液：貼壁細(xì)胞用冷的PBS輕輕清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g離心5分鐘后收集細(xì)胞；懸浮細(xì) 胞可直接離心收集。收集的細(xì)胞用冷的PBS洗滌3次。每 1×106 個(gè)細(xì)胞中加入150-200μLPBS重懸并通過反復(fù)凍融使細(xì)胞破碎(若含量很低可減少PBS的體積)。將提取液于1500×g離心10分鐘，取上清檢測。
6、 其他生物體液：1000×g 離心20分鐘，除去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片。取上清檢測。
試劑準(zhǔn)備
1、 使用前，所有的組分都要至少復(fù)溫60min，確保充分復(fù)溫到室溫。
2、 濃縮洗滌液：從冰箱取出的濃縮洗滌液，會有結(jié)晶產(chǎn)生，這屬于正常現(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶wan全溶解。濃縮洗滌液與蒸餾水，按1:20稀釋，即1份的濃縮洗滌液，添加19份的蒸餾水。
3、 底物：底物液A和B，在使用前，按1:1體積充分混合，混合后15分鐘內(nèi)使用。
操作程序
所有試劑和組分都先恢復(fù)到室溫，標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣品，建議做復(fù)孔。
1、 按前面說明書描述的方法，配制好試劑盒各種組分的工作液。
2、 從鋁箔袋中取出所需板條，剩余的板條用自封袋密封放回冰箱。
設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL，空白孔不加，樣本孔加待測樣本50μL。
3、除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗原100μL。
4、 用封板膜蓋住反應(yīng)板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5、 揭開封板膜，棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置20S，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)5次。若使用自動洗板機(jī)，請按洗板機(jī)操作程序進(jìn)行洗板，添加浸泡30s的程序，可以提高檢測的精度。洗板結(jié)束，加底物前，要在干凈不掉屑的紙上，充分拍干反應(yīng)板。
6、 將底物A和B按1:1體積充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL。用封板膜蓋住反應(yīng)板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育15min。
7、 所有孔加入終止液50μL，在酶標(biāo)儀上讀取各孔吸光度（OD值）。
結(jié)果計(jì)算
1、 以標(biāo)準(zhǔn)品濃度做為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的吸光度（OD值）作為縱坐標(biāo)，利用計(jì)算機(jī)軟件，采用四參數(shù)Logistic曲線擬合（4-pl），創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，通過樣本的吸光度（OD值），利用方程計(jì)算樣品的濃度值。
2、 如果樣品被稀釋，通過上述方法測的濃度值，要乘以稀釋倍數(shù)，才是樣品的最終濃度。
試劑盒性能指標(biāo)
1、物理性能
試劑盒的各液體組分應(yīng)澄清透明、無沉淀或者絮狀物。微孔板鋁箔袋應(yīng)真空包裝，無破損漏氣。
2、劑量反應(yīng)曲線線性
校準(zhǔn)品劑量反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù)r值，大于等于0.9900。
3、精密度
批內(nèi)精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行二十次在同一個(gè)板塊內(nèi)精度評估。批內(nèi)變異系數(shù)CV%小于10%。
批間精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行二十次在不同板塊內(nèi)精度評估。批間變異系數(shù)CV%小于15%。
4、靈敏度
最di檢出劑量小于0.1 ng/mL。
5、回收率
三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行五次在同一個(gè)板塊內(nèi)回收率評估，回收率在85%-115%之間。
6、特異性
本試劑盒識別天然和重組雄甾烯酮；雄烯酮（ADT），與結(jié)構(gòu)類似物無交叉。
7、穩(wěn)定性
2℃-8℃保存，有效期6個(gè)月。
8、 檢測范圍
0.625 ng/mL - 20 ng/mL