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2-8℃

1.蛋白酶抑制劑未開(kāi)蓋使用前也可以2-8℃儲(chǔ)存。開(kāi)蓋使用后-20℃儲(chǔ)存。
2.蛋白酶抑制劑在2-8℃低溫時(shí)是固體狀態(tài)，從冰箱取出后恢復(fù)至室溫或37℃短時(shí)間水浴，變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開(kāi)蓋。
3.試劑拆封后請(qǐng)盡快使用完！

一年

WB,IP等

植物

?使用方便。 ?將蛋白提取的時(shí)間縮短至1小時(shí)。 ?含蛋白穩(wěn)定劑，提取的蛋白穩(wěn)定。 ?紫外檢測(cè)蛋白濃度時(shí)，背景干擾低。 ?蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨(dú)立的蛋白酶抑制劑；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性。

WB,IP等

1.離心機(jī)
2.振蕩器
3.渦旋混勻器
4.移液器
5.冰箱
6.冰盒

1.PBS緩沖液
2.蛋白定量試劑盒

1.離心管
2.吸頭
3.一次性手套

使用注意事項(xiàng)：
? 旋帽離心管裝的試劑在開(kāi)蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開(kāi)蓋時(shí)液體灑落。
? 蛋白酶抑制劑在2-8℃時(shí)是固體狀態(tài)，從冰箱取出后恢復(fù)至室溫或37℃短時(shí)間水浴，變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開(kāi)蓋。
? 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的所有試劑須預(yù)冷；所有器具須放-20℃冰箱預(yù)冷。整個(gè)過(guò)程須保持樣品處于低溫。
? 蛋白酶抑制劑儲(chǔ)存期間溶液如果出現(xiàn)沉淀，不影響使用，溶解后正常使用。
? 如果試劑盒不能短時(shí)間內(nèi)用完，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次全部加入提取液。
? 可以根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)需要加入其它蛋白酶抑制劑單品。
?

1．提取液制備： 每300 μl冷的蛋白提取液B中加入2 μl蛋白酶抑制劑； 每300 μl冷的蛋白提取液D中加入2 μl蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。 【注】： ?根據(jù)需要處理的樣品數(shù)量準(zhǔn)備蛋白提取液，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次全部加入提取液。 ?加過(guò)蛋白酶抑制劑的提取液一周內(nèi)未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制劑。 ?以下步驟使用的蛋白提取液BD為此步驟添加了蛋白酶抑制劑的蛋白提取液。 2．取洗凈擦干后并去除葉梗和粗脈的200-500 mg植物組織樣本用刀盡可能剪碎，加入1 ml 提取液A后用勻漿機(jī)充分勻漿或者用勻漿器充分勻漿。 【注】： ?勻漿盡可能充分。至無(wú)明顯可見(jiàn)固體。 ?培養(yǎng)細(xì)胞直接收集細(xì)胞后用勻漿器勻漿即可，勻漿后加提取液A混勻后直接進(jìn) 行以下步驟離心。 ?處理葉片等組織樣本如果沒(méi)有勻漿機(jī)，也可先加少量提取液A后用Dounce勻漿器充分勻漿后再加提取液A混勻。 3．將勻漿液用100 μm細(xì)胞篩過(guò)濾。 【注】： ?沒(méi)有細(xì)胞篩時(shí)可以不過(guò)濾，將勻漿液靜置1分鐘，待大的沒(méi)有破碎的組織塊自然沉降，吸取上清。 ?部分黏液較多的植物樣本可能難以吸取，可以將1ml吸頭的口剪掉一點(diǎn)再吸。 4．將濾液在1000×g條件下離心10分鐘，收集上清（I），收集沉淀（I）。 5．在沉淀（I）中加入200-300 μl提取液B，充分混勻。 6．置振蕩器振蕩30分鐘。 【注】： ?用振蕩器/搖床的較低轉(zhuǎn)速，保持液體有輕微晃動(dòng)即可。 ?沒(méi)有低溫振蕩條件可以不振蕩，在2-8℃靜置，稍微延長(zhǎng)處理時(shí)間，中間每隔幾分鐘用移液器吹打混勻。 7．在4℃，10000×g條件下離心10分鐘。 8．將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管，即可得到核蛋白。 9．將上述蛋白提取物定量后分裝于-80℃冰箱保存?zhèn)溆没蛑苯佑糜谙掠螌?shí)驗(yàn)。 10．在第4步得到的上清（I）中加入10 μl提取液C，充分混勻。 【注】： ?添加試劑C時(shí)注意有效的加入，由于試劑C比較粘稠，可能會(huì)吸附在吸頭，沒(méi)有添加進(jìn)去，氣溫較低時(shí)可以把吸頭和試劑C在37℃預(yù)熱一下。 ?添加時(shí)不要將吸頭伸入到冷的試劑A中，會(huì)導(dǎo)致試劑C凝固而出不來(lái)，在接近液面的地方沿著離心管壁加入，注意觀察是否有效加入。 ?加入后充分混勻。 11．在2-8℃振蕩30-40分鐘。 【注】： ?此步驟必須在2-8℃條件。 ?使用較低轉(zhuǎn)速保持提取液稍微晃動(dòng)即可。 ?沒(méi)有振蕩條件可以不振蕩，置2-8℃靜置，稍微延遲處理時(shí)間，中間每隔幾分鐘用移液器吹打混勻。 12．在37℃水浴10分鐘。 13．在37℃下 1000×g離心3分鐘，此時(shí)溶液分為兩層，上層是胞漿蛋白部分，下層部分（II）是膜蛋白約為40-50 μl。 【注】： ?必需保證在37℃左右下離心，至少確保30℃以上。 ?無(wú)可控溫的離心機(jī)時(shí)，也可不離心，延長(zhǎng)37℃水浴時(shí)間至溶液變澄清，分層明顯即可。 14．將上層小心吸入另一預(yù)冷的干凈離心管，即可得到胞漿蛋白。 15．用50-100 μl冰冷的提取液D溶解步驟12中的下層部分（II），即得膜蛋白。 【注】： ?膜蛋白比較難溶解，不能很快溶解混勻，可以在加入溶解液后稍微吹打混勻，然后置于4℃冰箱靜置至溶解。中途用移液器輕輕吹打混勻一次。靜置后取出再次用移液器稍微吹打混勻即可。 ?靜置直至管底透明膠狀物溶解。 16．將上述蛋白提取物定量后分裝于-80℃冰箱保存?zhèn)溆没蛑苯佑糜谙掠螌?shí)驗(yàn)。 【注】： ?建議用BCA法進(jìn)行蛋白定量。相關(guān)產(chǎn)品：BB-3401。 ?蛋白樣品－80℃存放一年沒(méi)有問(wèn)題。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被細(xì)菌污染。

?蛋白濃度低？ 植物核蛋白和膜蛋白豐度比較低，在條件允許的情況下，盡可能增加樣本量。 處理部分樣本時(shí)可能沒(méi)有裂解，導(dǎo)致蛋白濃度低。只要適當(dāng)增加試劑A的勻漿次數(shù)，并適當(dāng)延長(zhǎng)試劑B和C的處理時(shí)間即可。在持續(xù)振蕩的條件下處理，沒(méi)有振蕩器也可間隔幾分鐘用吸頭吹打混勻。 ?用什么方法定量蛋白？ 建議用BCA法。不適合用Bradford法，因?yàn)樵噭〢中含有干擾Bradford法的組份，導(dǎo)致定量不準(zhǔn)。如果已經(jīng)進(jìn)行過(guò)透析處理或者用脫鹽柱改換過(guò)緩沖體系，則可以用Bradford法定量。 ?提取時(shí)出現(xiàn)膠狀沉淀？ 核蛋白提取液處理產(chǎn)物中有時(shí)會(huì)出現(xiàn)少量透明膠狀物，屬正常現(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復(fù)合物。不檢測(cè)和基因組DNA結(jié)合特別緊密的特定蛋白的情況下，可以直接離心取上清進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)即可；如果需要檢測(cè)和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，則可以通過(guò)超聲處理，300w/10秒間隔10秒，超聲3分鐘，隨后離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 ?提取的蛋白具有活性嗎？ 本試劑盒不含有離子型去垢劑組份，不破壞蛋白的結(jié)構(gòu)，沒(méi)有對(duì)蛋白質(zhì)之間原有的相互作用的破壞，蛋白均保持其天然構(gòu)象和活性。

?Yu Du et al. Phytophthora infestans RXLR effector PITG20303 targets a potato MKK1 protein to suppress plant immunity New Phytologist 2020 （IF=8.512） ?Li Sun et al. Endogenous ABA alleviates rice ammonium toxicity by reducing ROS and free ammonium via regulation of the SAPK9–bZIP20 pathway Journal of Experimental Botany 2020 （IF=5.36） ?Binhui Zhan et al. Functional Scanning of Apple Geminivirus Proteins as Symptom Determinants and Suppressors of Posttranscriptional Gene Silencing Viruses. 2018 （IF=3.761）