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產(chǎn)品概述 product description 貝博® BBproExtra® 植物高爾基體膜蛋白提取試劑盒提供全套試劑，適用于從各種植物組織樣本的高爾基體膜蛋白提取。提取過程簡單方便，可在1小時內(nèi)完成。提取的膜蛋白不僅純度高，保持天然活性，而且絕少交叉污染。本試劑盒含有的配方能夠有效溶解膜組份。本試劑盒含有的蛋白酶抑制劑混合物，阻止了蛋白酶對蛋白的降解，為提取高純度的蛋白提供了保證。本試劑盒提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白質(zhì)電泳、免疫沉淀、ELISA、酶活性測定等下游蛋白研究實驗。本試劑盒提取的蛋白為具有天然蛋白構(gòu)象的活性蛋白。本試劑盒中不含有EDTA，與金屬螯和層析等下游應(yīng)用兼容。

保存溫度

2-8℃

注意事項

1.蛋白酶抑制劑未開蓋使用前也可以2-8℃儲存。開蓋使用后-20℃儲存。
2.蛋白酶抑制劑在2-8℃低溫時是固體狀態(tài)，從冰箱取出后恢復(fù)至室溫或37℃短時間水浴，變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開蓋。
3.試劑拆封后請盡快使用完！

有效期

一年

檢測方法

WB,IP等

適用樣本

植物

產(chǎn)品應(yīng)用

WB,IP等

儀器準(zhǔn)備

1.離心機
2.振蕩器
3.渦旋混勻器
4.移液器
5.冰箱
6.冰盒

試劑準(zhǔn)備

1.PBS緩沖液
2.蛋白定量試劑盒

耗材準(zhǔn)備

1.離心管
2.吸頭
3.一次性手套

使用注意事項

使用注意事項：
? 旋帽離心管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。
? 實驗過程中的所有試劑須預(yù)冷；所有器具須放-20℃冰箱預(yù)冷。整個過程須保持樣品處于低溫。
? 使用Dounce勻漿器勻漿，如果沒有Dounce勻漿器，用普通玻璃勻漿器勻漿也可，但是蛋白回收率會下降。
? 提取液C在使用前須一直置于2-8℃條件，否則下游膜蛋白提取時會導(dǎo)致不容易分層。
? 膜蛋白電泳時loading buffer應(yīng)該避免煮沸。
? 膜蛋白電泳時可以提高loading buffer的SDS含量。
? 離心機轉(zhuǎn)速有相對離心力（RCF，×g）和每分鐘轉(zhuǎn)速（RPM，r/min）兩種表示方式，有些離心機設(shè)置有RPM和×g顯示切換，但部分離心機沒有自動切換功能。需要用下面的公式進(jìn)行換算：
g=r×1.118×10-5×rpm2 （r 為有效離心半徑，即從離心機軸心到離心收集管底部中心位置的長度，單位為厘米) 例如: 轉(zhuǎn)速為3000rpm，有效離心半徑為10 cm，則相對離心力（RCF，×g）為=10×1.118×10-5×30002=1006.2（×g）。

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使用方法

1. 提取液準(zhǔn)備：
每500 μl冷的蛋白提取液C中加入2 μl蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。
2. 取100-200 mg新鮮植物葉片組織樣本，用PBS洗滌干凈。
3. 用剪刀盡可能剪碎，用冷PBS洗滌兩次。
4. 加入1000 μl冷的試劑 A，置冰上10分鐘。
5. 用勻漿機/勻漿器充分勻漿。
6. 勻漿液在4℃，1000×g力條件下離心5分鐘。棄沉淀，收集上清。
7. 上清在4℃，3000×g力條件下離心10分鐘。棄沉淀，將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管。
8. 將上清在4℃，6000×g力條件下離心10分鐘。棄沉淀，收集上清。
9. 上清在4℃，50000×g力條件下離心20分鐘。棄上清，留沉淀。
10. 在沉淀中加入500 μl冷的試劑B，混勻。
11. 在4℃，50000×g力條件下離心30分鐘。棄上清，收集沉淀。
12. 在沉淀中加入400 μl蛋白提取液C，吹打混勻后，在4℃條件下振蕩15-30分鐘，至沉淀充分裂解，無明顯沉淀。
13. 在4℃，12000×g條件下離心5分鐘。
14. 將上清吸入另一干凈離心管，在37℃水?。庠。?5分鐘。
15. 在37℃， 1000×g離心5分鐘。此時溶液分為2層，下層是膜蛋白約為30-50 μl。
16. 小心移除上層，留下下層大約40 μl液體。
17. 用50-100 μl膜蛋白溶解液D溶解下層，即可得到高爾基體膜蛋白樣品。
18. 將上述蛋白提取物定量后分裝于-80℃冰箱保存?zhèn)溆没蛑苯佑糜谙掠螌嶒灐?br>

常見問題分析

1.蛋白濃度低？
膜蛋白豐度比較低，在條件允許的情況下，需要盡可能加大組織樣本上樣量以提高膜蛋白濃度。
減少膜蛋白溶解液用量。

2.用什么方法定量蛋白？
建議用BCA法。不適合用Bradford法，因為試劑中含有干擾Bradford法的組份，導(dǎo)致定量不準(zhǔn)。如果已經(jīng)進(jìn)行過透析處理或者用脫鹽柱改換過緩沖體系，則可以用Bradford法定量。

3.提取的蛋白具有活性嗎？
本試劑盒不含有離子型去垢劑組份，不破壞蛋白的結(jié)構(gòu)，沒有對蛋白質(zhì)之間原有的相互作用的破壞，蛋白均保持其天然構(gòu)象和活性。

4.膜蛋白電泳沒有條帶？
膜蛋白樣品通常濃度較低，電泳前一定要進(jìn)行蛋白定量，以保證電泳是蛋白上樣量足夠。
膜蛋白提取好后，用溶解液充分溶解后，可以超聲處理一下，再進(jìn)行蛋白定量。
蛋白加Loading buffer后可以不用煮沸，采用50℃保溫30分鐘。
蛋白Loading buffer中SDS終濃度含量可以提高至3%-10%。
有些樣品的膜蛋白含量太低，可以使用丙酮沉淀膜蛋白，再使膜蛋白溶解于上樣緩沖液中，一般可以跑出清晰的蛋白條帶。
電泳時采用低電壓低電流電泳。
膜蛋白豐度通常較低，有條件可以嘗試用銀染染色。

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