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詳細介紹
人皮膚T細胞虜獲趨化因子(CTACK/CCL27)適用于以下樣本的測試
血清、血漿–組織勻漿–腹水–細胞、培養(yǎng)上清
本試劑盒僅供研究，不用于臨床診斷
一、實驗原理：
本試劑盒采用競爭法檢測樣本中人皮膚T細胞虜獲趨化因子(CTACK/CCL27)的含量。向預先包被了抗體的酶標孔中加入樣本，再加入生物素標記的識別抗原，在37℃下孵育30min，兩者與固相抗體競爭結(jié)合形成免疫復合物，經(jīng)PBST洗滌除去未結(jié)合的生物素抗原，然后加入親和素-HRP，在37℃下孵育30min，親和素-HRP與生物素抗原結(jié)合，洗滌后結(jié)合的HRP催化TMB（四甲基聯(lián)苯胺）成藍色，隨后在酸的作用下轉(zhuǎn)化成黃色，在450nm波長下有吸收峰，吸光值與樣本中抗原的濃度成負相關(guān)
二、試劑盒組成：
注：
a、試劑盒中“樣品稀釋液”為0.05M的PBS，“終止液”為2M的H2SO4，洗滌液為含0.15%吐溫-20的PBST，如不夠可自行配制。
b、不同公司的緩沖體系存在較大差異，請勿將本試劑盒的試劑與其他公司的試劑混用以免影響實驗結(jié)果。
c、濃縮洗滌液在低溫下會有少量鹽類析出，稍微加溫后即會消失，不影響使用。
三、試劑盒保存
本試劑盒可以在2-8℃下保存6個月，在-20℃下可以保存更長的時間。酶標板為真空包裝，板條可以拆卸，拆開以后如一次不能用完，請放入提供的密封袋中，放入干燥劑，2-8℃保存，在一個月之內(nèi)仍然有效。試劑不能反復凍融。
四、需要而未提供的試劑和器材
a、37℃恒溫箱。
b、標準規(guī)格酶標儀。
c、精密移液器及一次性吸頭
d、雙蒸水或超純水
e、干凈的試管或Eppendof管
f、吸水紙
g、自動洗板機或8道排槍
h、ELISA數(shù)據(jù)處理軟件，推薦使用ELISACalc
i、500ml燒杯的和適當量程的量筒
五、試劑準備
a、使用前所有試劑應(yīng)置于室溫平衡至少30分鐘。
b、本試劑盒可以直接加樣，如濃度過高，可以進行適當比例的稀釋，計算時應(yīng)將結(jié)果乘以稀釋的倍數(shù)（建議先做預實驗，以確定稀釋倍數(shù)）。
c、洗滌液為25倍濃縮液，使用前將所有洗滌液倒入500ml或1L的燒杯中，用雙蒸水定容到500ml即為工作液。
d、標準品的稀釋：先用標準品/樣品稀釋液漿標準品凍干粉定容到150μl，然后漩渦混勻30秒即為標準品原液(24小時內(nèi)用完)。取5支干凈的Eppendorf管，每管加150μl的標準品稀釋液，分別標記上32ng/ml，16ng/ml，8ng/ml，4ng/ml，2ng/ml。取150μl標準品原液加入標記32ng/ml 的管中，混勻后同樣取出150μl，加入下一管，以此類推直至后一管。] （見下圖）
零孔：直接加標準品/樣品稀釋液。
原液64ng/ml 32ng/ml 16ng/ml 8ng/ml 4ng/ml 2ng/ml
e、生物素抗原的稀釋：低速離心，然后抽取生物素抗原稀釋液1ml到濃縮型生物素抗原中，漩渦混勻15秒，至凍干粉*溶解，然后將所有液體倒入稀釋液瓶中，漩渦混勻后即為生物素抗原工作液(一周內(nèi)用完)。
f、親和素-HRP的稀釋：低速離心，使?jié)饪s液全部沉到管底，將濃縮親和素-HRP全部轉(zhuǎn)移到稀釋液瓶中，漩渦混勻后即為親和素-HRP工作液(一周內(nèi)用完)。
六、樣本前處理
a、標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復凍融。
b、血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，2000-3000轉(zhuǎn)/分，離心 20分鐘左右。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。
c、血漿：應(yīng)根據(jù)標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，2000-3000轉(zhuǎn)/分，離心 20分鐘左右。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
d、尿液：用無菌管收集，2000-3000轉(zhuǎn)/分，離心 20分鐘左右。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
e、細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。2000-3000轉(zhuǎn)/分，離心 20分鐘左右。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS (PH7.2-7.4)稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。2000-3000轉(zhuǎn)/分，離心 20分鐘左右。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
f、組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?-8℃的溫度。加入一定量的PBS(PH7.4)，用手工或勻漿器將標本勻漿充分。2000-3000轉(zhuǎn)/分，離心 20分鐘左右。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。
七、洗板方法
a、手工洗板：先洗去酶標孔中的的液體，在吸水紙上拍干，然后每孔加入300μl稀釋好的洗滌液，輕輕搖晃30秒，然后甩掉，在吸水紙上拍干，重復4-5次。
b、洗板機洗板：洗板機洗板比較便捷，但應(yīng)操作熟練后使用。
八、詳細操作程序
a、使用前請先將試劑盒在室溫下平衡半小時。
b、空白孔不加樣，只加顯色劑A，B和終止液用于調(diào)零。
c、標準品孔：每孔加入稀釋好的標準品50μl，零孔加入標準品/樣品稀釋液50μl，然后加入生物素抗原工作液50μl。
d、樣品孔：加入樣品50μl，然后加入生物素抗原工作液50μl。
e、輕輕搖晃，蓋上封板膜，37℃培養(yǎng)箱中孵育30min。
f、將25倍濃縮洗滌液用蒸餾水25倍稀釋后備用。
g、*次洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。
h、加入50μl親和素-HRP到標準品孔和樣品孔中，輕輕搖晃，蓋上封板膜，37℃培養(yǎng)箱中孵育30min。
i、第二次洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。
j、顯色：每孔先加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘。
k、終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
l、測定：以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應(yīng)在加終止液后10分鐘以內(nèi)進行。
m、計算：根據(jù)濃度和OD值算出標準曲線的回歸方程，建議用計算軟件進行計算，推薦使用人皮膚T細胞虜獲趨化因子(CTACK/CCL27)calc進行計算，擬合模型選用logistic曲線（四參數(shù)）。標曲示意圖如下：
九，操作總結(jié)
準備試劑，樣品和標準品
加入準備好的樣品和標準品，生物素抗原，37℃反應(yīng)30分鐘
洗板5次，加入親和素-HRP，37℃反應(yīng)30分鐘
洗板5次，加入顯色液A、B，37℃顯色10分鐘
加入終止液
10分鐘之內(nèi)讀OD值
計算
10、性能參數(shù)
a、批內(nèi)差：CV＜10%
b、批間差：CV＜12%
c、檢測限：0.2-60ng/ml
d、保 存：2-8℃
e、規(guī) 格：96T/盒
f、有效期：6個月(2-8℃)
11、問題分析
購買人皮膚T細胞虜獲趨化因子(CTACK/CCL27)聲明：1、限于現(xiàn)有條件及科技水平，尚不能對所有原料進行全面分析，本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風險。
2、終的實驗結(jié)果與試劑的有效性、實驗者的相關(guān)操作及當時的實驗環(huán)境密切相關(guān)，請務(wù)必準備充足的待測樣本并預留備份，并根據(jù)預實驗結(jié)果調(diào)整樣本濃度。
3、試驗中請穿著實驗服并帶乳膠手套做好防護工作。特別是檢測血液或者其他體液樣品時，請按國家生物試驗室安全防護條例執(zhí)行。
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