兩管式RT-PCR試劑盒（MMLV-Taq）是整合 cDNA *鏈合成試劑和即用型 PCR 試劑而得的 RT-PCR 試劑盒。cDNA *鏈合成反應(yīng)和 PCR 反應(yīng)分別在兩個(gè)離心管中進(jìn)行。

兩管式RT-PCR試劑盒（MMLV-Taq）具有下列特點(diǎn)：
1. 即開即用，足夠 50 次 RT 反應(yīng)（20 uL 體系）和 600 次 PCR 反應(yīng)（30 uL 體系）。
2. cDNA *鏈合成試劑盒可靈活選用隨機(jī)引物、Oligo dT 引物或基因?qū)Ｒ灰?，適合
各種情況。
3. PCR 試劑盒具有即用、簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，PCR mix 中含上樣染料，所以 PCR 產(chǎn)物可以直
接上樣電泳。
4. 兩管式操作，RT 和 PCR 在不同試管中進(jìn)行，便于單獨(dú)優(yōu)化 RT 反應(yīng)或 PCR 反應(yīng)條件。
5. 擴(kuò)增效率高, zui長(zhǎng)可擴(kuò)增 5 Kbp 以上的 RNA。
規(guī)格及成分
成 分 編 號(hào) 50 次塑料袋包裝
RT 試劑盒（CAT#:60906） 60906 50 次
即用型PCR試劑盒3.0（CAT#:90805） 90805 9 mL
使用手冊(cè) 80206sc 1 份
RT 試劑盒（CAT#:60906）成分表：
RT 試劑盒成分 50 次包裝
MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶 (含 RI) 100 uL
RT Buffer（含 dNTP） 300 uL
Oligo (dT)18 引物(0.5ug/uL) 50 uL
隨機(jī)引物(0.2 ug/uL) 50 uL
RNase-free 水 10 mL
即用型 PCR 試劑盒 3.0（CAT#:90805）成分表：
即用型 PCR 試劑盒 3.0 成分 600 次包裝
PCR MagicMix 3.0 9 mL
染料 360 uL
運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸,-20℃保存, 有效期一年。
自備試劑 樣品 RNA、模板專一正向和反向引物。
使用方法 一、樣品 RNA 的制備（本試劑盒不提供相關(guān)試劑）
1、可用自本公司各種 RNA 提取方法提取樣品的 RNA，也可以選用其他供應(yīng)商的產(chǎn)品，但
得到的 RNA 一定要溶解在 RNase-free 的超純水中。
二：RT（逆轉(zhuǎn)錄）反應(yīng)合成 cDNA
1. 按下表配制 RT 反應(yīng)體系（20 uL 體系）:
RNA 模板
總 RNA 100-500 ng
或 poly(A) mRNA 10-500 ng
或?qū)Ｒ坏?RNA（如體外轉(zhuǎn)錄制備的） 0.01 pg-500 ng
引物
Oligo (dT)18(0.5 ug/uL) 1 uL
或隨機(jī)引物(0.2 ug/uL) 1 uL
或自備模板專一反向引物(10 pmol/uL) 1-2 uL
RNase-free 水 補(bǔ)水到 12 uL
注意：RNA 樣品不能含有基因組 DNA 污染。隨機(jī)引物與 RNA 模板的比例將決定
cDNA 合成的平均長(zhǎng)度（成反比）。一般情況下隨機(jī)引物效率好于 OligodT 引物，但
如果只想轉(zhuǎn)錄總 RNA 中的 mRNA（只占 5%左右），則可優(yōu)先選用 OligodT 引物，
這樣就可以排除非 mRNA 的干擾。
2. 70℃保溫 5 分鐘變性模板后立即冰浴。
3. 按順序加入 6 uL RT Buffer（含 dNTP）和 2 uLMMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（含 RI），反
應(yīng)終體積為 20 uL。
4. 42℃保溫 60 分鐘。此步為 RT 反應(yīng)。
5. 70℃保溫 10 分鐘以終止反應(yīng)，然后放置在冰上待用。
6. 合成的 cDNA 可以直接作為 PCR 模板使用，不需要純化。剩余樣品可以放置在
-20℃長(zhǎng)期保存。
三、PCR（30 uL 體系）
1、將全部染料加入到 PCR MagicMix 3.0 中，輕柔顛倒混勻即可使用。未用完的部
分需要在-20℃。也可以不加染料，但在 PCR 結(jié)束后，電泳上樣前，則需要加入
電泳上樣液，否則電泳時(shí)沒法判斷電泳速度。
2、在 PCR 管中加入下列成分：
成分 加入量
PCR MagicMix 3.0（已加染料） 15 uL
cDNA 樣品（上步的 RT 反應(yīng)液） 1-5 uL
模板專一性正向引物(10 pmol/uL) 1-2 uL
模板專一性反向引物(10 pmol/uL) 1-2 uL
補(bǔ)水到 30 uL
注意：cDNA 也可以稀釋后用作 PCR 模板。是否稀釋或稀釋多少倍*取決于靶基因
的豐度。
2、PCR 反應(yīng)參數(shù)(需要根據(jù)模板和引物決定，下面的只做參考)：
過(guò)程 溫度 時(shí)間
預(yù)變性 94℃ 5 min
PCR 反應(yīng)
（35 個(gè)循環(huán)）
94℃ 1 min
55℃ 1 min
72℃ 2 min
zui后延伸 72℃ 10 min
四、電泳檢測(cè)
1、取 5-0 uL PCR 產(chǎn)物直接在 PAGE 或瓊脂糖凝膠上電泳，跟分子量標(biāo)準(zhǔn)比較估計(jì)出擴(kuò)
增產(chǎn)物的大小。注：本試劑盒中的 PCR mix 含有甘油和染料，可以直接上樣，不需要
額外再加電泳上樣液。
關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 雙酶一管式 RT-PCR 試劑盒（CAT#:91202-50）