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細(xì)胞同步化實驗操作步驟
閱讀：3824 發(fā)布時間：2017-6-29在腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)過程中，細(xì)胞多處于不同的細(xì)胞周期時相中。不同時相的細(xì)胞對藥物干預(yù)存在不同的反應(yīng)，會影響實驗的重復(fù)性，因此需要制備細(xì)胞周期一致的細(xì)胞。細(xì)胞同步化是解決該問題的好辦法。細(xì)胞同步化是利用藥物或其他方法使細(xì)胞停止在細(xì)胞周期的某個時相的技術(shù)，其基本原則是使細(xì)胞停留在細(xì)胞周期的特定時相上；停滯過程可以通過調(diào)節(jié)，恢復(fù)細(xì)胞周期；恢復(fù)后所有細(xì)胞以一致的步調(diào)在細(xì)胞周期中運行。細(xì)胞同步化實驗為特定細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變、細(xì)胞動力學(xué)、細(xì)胞周期調(diào)控以及細(xì)胞在不同時相中對藥物的敏感性研究奠定了基礎(chǔ)。
【實驗用品】
材料：HeLa細(xì)胞
器材：培養(yǎng)瓶、移液器、槍頭、小燒杯、10ml吸管橡皮頭、超凈工作臺、CO2，孵箱、倒置相差顯微鏡、離心機(jī)
試劑：無血清培養(yǎng)基、胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)液、0.25％胰蛋白酶溶液、PBS
【實驗步驟】
(1)血清饑餓法(將細(xì)胞周期阻滯在G0／G1)：
1)用0．25％胰蛋白酶消化對數(shù)生長期HeLa細(xì)胞，收集腫瘤細(xì)胞，600g離心5min，棄上清液。
2)用37℃預(yù)溫pH7．4的PBS或無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次，重懸于培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中血清濃度低于O.5％。
3)在CO2孵育箱中37℃、5％CO2以及飽和濕度的條件下，培養(yǎng)24～48h。
4)棄去無血清培養(yǎng)液，加入正常血清濃度的培養(yǎng)液，使細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期。細(xì)胞約在12h后進(jìn)入S期。
(2)胸苷法(誘導(dǎo)細(xì)胞停滯在Gl／s期交界)：
1)添加含2mmol／L胸苷的新鮮培養(yǎng)液于培養(yǎng)對數(shù)生長期HeLa細(xì)胞細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中。
2)在CO2孵育箱中37℃、5％CO2以及飽和濕度的條件下，培養(yǎng)12h。
3)棄去含有胸苷的培養(yǎng)液，用等量的*培養(yǎng)液洗滌貼壁細(xì)胞2次。更換新鮮培養(yǎng)液，在37℃的CO2孵育箱中孵育16h。
4)棄去培養(yǎng)液，再加入2mmoL／I_胸苷的新鮮培養(yǎng)液，并孵育12～14h。
5)重復(fù)本實驗(2)胸苷法中的第3)步驟。
(3)有絲分裂搖落法(將細(xì)胞截獲于M期)：
1)取覆蓋瓶底70％～80％的HeLa細(xì)胞細(xì)胞1瓶，棄去原培養(yǎng)液，用無血清培養(yǎng)液沖洗。然后加入：3ml 0．1％胰蛋白酶消化5min。輕叩培養(yǎng)瓶，使松動細(xì)胞游離下來。
2)60％離心5min，并調(diào)整細(xì)胞濃度至2．5x105個／ml，種入培養(yǎng)瓶，于37℃的CO2孵育箱中孵育6h。
3)搖動培養(yǎng)瓶，棄去未貼壁的細(xì)胞，更換培養(yǎng)液2次。加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)10h。
4)在10h結(jié)束，輕輕搖動或輕叩培養(yǎng)瓶，收集M期細(xì)胞，600g離心5min，并用培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)整到2．5×105個／ml。
5)種入培養(yǎng)瓶，于37℃的CO2孵育箱中孵育2h，細(xì)胞進(jìn)入G1期。以上方法可應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測獲得細(xì)胞的細(xì)胞周期(見流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期)。
【結(jié)果分析】
根據(jù)以上三種方法進(jìn)行得到不同時相的同步化細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞群體的細(xì)胞周期的均一性。
【注意事項】
(1)血清饑餓法必須注意無血清培養(yǎng)液處理細(xì)胞的時間，時間過長將引起細(xì)胞不可逆進(jìn)入G0期或凋亡。
(2)有絲分裂搖落法必須注意胰蛋白酶的消化時間，過長的消化時間將引起其他周期的腫瘤細(xì)胞數(shù)目增加。