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細(xì)胞養(yǎng)不好，注意這些細(xì)節(jié)

養(yǎng)細(xì)胞是一件戳心戳肺的事情，你要像照顧小孩一樣仔細(xì)對待，愛護(hù)她，呵護(hù)她。如果你照顧的時候能注意這些問題，會讓你的細(xì)胞養(yǎng)的更好。下面就將養(yǎng)細(xì)胞的注意事項跟大家交流一下。

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細(xì)胞培養(yǎng)前的準(zhǔn)備

在您帶上手套開始細(xì)胞培養(yǎng)之前,先檢查一下移液管和瓶子的數(shù)量是否充足,以免在開始實驗后再次出入操作臺，這樣可以降低細(xì)胞污染的風(fēng)險。

細(xì)胞培養(yǎng)基也應(yīng)先預(yù)熱,選擇只預(yù)熱部分培養(yǎng)基而非整瓶加熱,不但可以節(jié)約實驗時間,而且可以避免因反復(fù)加熱培養(yǎng)基而造成的蛋白質(zhì)降解。

結(jié)束操作后,別忘了培養(yǎng)基對光敏感,應(yīng)盡可能避光保存。

細(xì)胞培養(yǎng)的定期檢查

定期檢查培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)，即形狀和外觀，對于細(xì)胞培養(yǎng)實驗取得成功至關(guān)重要。

除確認(rèn)細(xì)胞的健康狀態(tài)外，每次操作細(xì)胞時通過肉眼和顯微鏡檢查細(xì)胞還可早期發(fā)現(xiàn)污染征象，避免污染擴(kuò)散至實驗室其他細(xì)胞。

細(xì)胞變質(zhì)的征象

細(xì)胞變質(zhì)的征象包括核周出現(xiàn)顆粒、細(xì)胞與基質(zhì)解離以及細(xì)胞質(zhì)空泡形成。

這些變質(zhì)征象可能為多種原因所致，例如：

培養(yǎng)物污染、細(xì)胞系衰老或培養(yǎng)基中存在毒性物質(zhì)，或者這些征象僅表明培養(yǎng)物需要更換培養(yǎng)基。

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變質(zhì)嚴(yán)重時將會成為不可逆的變化。

細(xì)胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥的消毒及布局

保持細(xì)胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥內(nèi)的整潔有序，將所有物品置于直視范圍內(nèi)。

向放入通風(fēng)櫥內(nèi)的所有物品噴灑70%乙醇，擦拭清潔進(jìn)行消毒。

在通風(fēng)櫥中部開闊處放置細(xì)胞培養(yǎng)容器；移液器置于右前方易于取用；試劑和培養(yǎng)基置于右后方便于吸取；試管架置于中后部；小型容器置于左后部用于盛放廢液。

培養(yǎng)瓶/皿等物品的無菌操作

無菌培養(yǎng)瓶、試劑瓶、培養(yǎng)皿等物品使用時方可揭開蓋子，不得將其開放暴露于環(huán)境中，操作完成后盡快蓋上蓋子，取下蓋子時應(yīng)將蓋子開口朝下放在工作臺面上。

進(jìn)行無菌操作時不要說話、唱歌或吹口哨。盡快完成實驗，以盡量避免污染。

細(xì)胞培養(yǎng)中可能的污染物

細(xì)胞培養(yǎng)污染物主要分為兩類：

化學(xué)污染物,如培養(yǎng)基、血清和水中的雜質(zhì)、內(nèi)毒素、增塑劑和去污劑。

生物污染物，如細(xì)菌、霉菌、酵母、病毒、支原體以及其他細(xì)胞系的交叉污染。

可通過充分了解污染源以及采用良好的無菌技術(shù)，降低污染發(fā)生的頻率和嚴(yán)重程度。

交叉污染的確認(rèn)

交叉污染雖不如微生物污染普遍，但與HELA細(xì)胞及其他生長迅速的細(xì)胞系間廣泛的交叉污染是個明確的問題，會造成嚴(yán)重后果。

從聲譽好的細(xì)胞庫獲取細(xì)胞系、定期檢查細(xì)胞系性質(zhì)及采用良好的無菌技術(shù)有助于避免交叉污染。

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通過DNA指紋圖譜、核型分析和同位素分析可確認(rèn)有無交叉污染。

細(xì)胞換液注意事項

為細(xì)胞換液時，要沿著培養(yǎng)瓶的一側(cè)輕輕地加入，而不是直接加到細(xì)胞中，以免損傷細(xì)胞，當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞株較為脆弱時尤其需要注意。

使用無菌玻璃吸管或一次性塑料吸管和移液器操作液體時，每支吸管只能使用一次，以免交叉污染。

細(xì)胞傳代的時間把握

當(dāng)細(xì)胞呈指數(shù)增殖，貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞已占據(jù)所有可用基質(zhì)、沒有擴(kuò)增空間，或懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞已超過培養(yǎng)基質(zhì)所支撐的能力，無法進(jìn)一步生長時，細(xì)胞增殖速度將大大降低甚至*停止。

為了將細(xì)胞密度維持在zui佳水平，以便細(xì)胞繼續(xù)生長，并且刺激進(jìn)一步增殖，必須對細(xì)胞進(jìn)行傳代。

細(xì)胞培養(yǎng)中使用抗生素的注意事項

細(xì)胞培養(yǎng)時不應(yīng)長期使用抗生素，因為連續(xù)使用抗生素會促進(jìn)抗生素耐藥性細(xì)胞株的產(chǎn)生，導(dǎo)致輕度污染持續(xù)存在。

抗生素只能作為對付污染的zui后手段短期使用，并盡快撤除。

如果長期使用抗生素，則應(yīng)同時進(jìn)行無抗生素培養(yǎng)，以便作為鑒別隱性感染的對照。

細(xì)胞凍存的必要性

連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞系容易發(fā)生遺傳漂變，有限細(xì)胞系zui終會發(fā)生衰老，所有培養(yǎng)的細(xì)胞都易受到微生物污染，即使運轉(zhuǎn)情況zui好的實驗室也會遇到設(shè)備故障的問題。

由于已建立的細(xì)胞系是一種寶貴資源，更換細(xì)胞系成本高昂，而且耗費時間，因此，必須將其冷凍起來，長期保存。

細(xì)胞凍存的事項

應(yīng)在細(xì)胞濃度高的情況下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)凍存，并且細(xì)胞傳代的次數(shù)盡可能少。

在凍存前確保活細(xì)胞的百分比至少為90%。

請注意，zui佳凍存條件取決于所用細(xì)胞系。

凍存和復(fù)蘇過程對大多數(shù)細(xì)胞都會造成不利影響，因此不要通過渦旋震蕩或者用力敲打培養(yǎng)瓶的方法使細(xì)胞脫落（培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞時除外），也不要高速離心細(xì)胞。

凍存培養(yǎng)基的選擇

凍存細(xì)胞時必須選擇凍存培養(yǎng)基，凍存培養(yǎng)基中應(yīng)含有DMSO或者甘油等冷凍保護(hù)劑。

還可使用專門配制的*凍存培養(yǎng)基，例如HyClone、HAKATA的細(xì)胞凍存培養(yǎng)基。

細(xì)胞培養(yǎng)溫度的設(shè)定

細(xì)胞培養(yǎng)的zui佳溫度主要取決于細(xì)胞供體的體溫，此外也受到解刨部位體溫差異的影響，例如：皮膚溫度低于骨骼肌的溫度。

與溫度過低相比，細(xì)胞培養(yǎng)時溫度過高時更為嚴(yán)重的問題：因此，往往將培養(yǎng)箱的溫度設(shè)定為略低于zui佳溫度。

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各類細(xì)胞培養(yǎng)的zui佳溫度

大多數(shù)人和哺乳動物細(xì)胞系在36℃~37℃下具有zui佳生長狀態(tài)。

昆蟲細(xì)胞在27℃具有zui佳生長狀態(tài)；在低于27℃以及27至30℃范圍內(nèi)，細(xì)胞生長較慢。

溫度超過30℃時，昆蟲細(xì)胞活力降低，即使溫度降至27℃，細(xì)胞活力也無法恢復(fù)。

禽類細(xì)胞系在38.5℃時具有zui佳生長狀態(tài)。雖然此類細(xì)胞也可在37℃下培養(yǎng)，但其生長速度會變慢。

來源于冷血動物（例如：兩棲動物、冷水魚）的細(xì)胞系可耐受很寬的溫度范圍，為15-26℃。

請注意每種細(xì)胞的培養(yǎng)條件均有所不同，偏離某種細(xì)胞所需的培養(yǎng)條件會導(dǎo)致細(xì)胞表型異常，甚至培養(yǎng)*失敗。

因此，我們建議您應(yīng)熟悉自己使用的細(xì)胞系，實驗中嚴(yán)格遵守所有產(chǎn)品附帶的操作說明。

細(xì)胞培養(yǎng)的zui適pH

大多數(shù)正常的哺乳動物細(xì)胞系都能在pH值為7.4的環(huán)境中生長良好，而且不同細(xì)胞株間差異極小。

但是，目前發(fā)現(xiàn)有些轉(zhuǎn)化細(xì)胞系在輕度偏酸性的環(huán)境中即pH7.0-7.4時生長較好，而有些正常的成纖維細(xì)胞系更適合輕度偏堿性的環(huán)境即pH為7.4-7.7。

Sf9和Sf21等昆蟲細(xì)胞系zui適合在pH值為6.2的環(huán)境中生長。

細(xì)胞培養(yǎng)基zui適pH的控制

細(xì)胞培養(yǎng)基可控制培養(yǎng)體系的pH值，為培養(yǎng)的細(xì)胞緩沖pH值的變化。

這種緩沖作用通常是通過添加有機緩沖鹽（例如：HEPES）或者二氧化碳-碳酸氫鹽緩沖鹽實現(xiàn)。

由于培養(yǎng)基的pH值取決于溶解態(tài)二氧化碳與碳酸氫鹽間的精密平衡，因此空氣中二氧化碳含量的變化會改變培養(yǎng)基的pH值。

為此，使用二氧化碳-碳酸氫鹽緩沖鹽培養(yǎng)基時必須使用外源性二氧化碳，特別是使用開放式培養(yǎng)皿培養(yǎng)細(xì)胞或者進(jìn)行高濃度的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系培養(yǎng)時。

細(xì)胞培養(yǎng)中血清的保存

細(xì)胞培養(yǎng)中所用的血清不盡相同，您需要根據(jù)您所培養(yǎng)的細(xì)胞種類和培養(yǎng)要求來挑選出zui適合的血清。

我們建議將血清保存在-10至-20℃，若存放于4℃，請勿超過一個月。

若您無法一次用完一瓶，建議您將血清無菌分裝至合適體積的滅菌容器內(nèi)，再放回冷凍箱保存。

解凍血清時，建議您將血清從冷凍箱取出后，先置于2-8℃冰箱過夜融解，然后在室溫下使之全融。需要注意的是，融解過程中必須規(guī)則地?fù)u晃均勻。

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如何在細(xì)胞鋪板時避免“邊緣效應(yīng)”

細(xì)胞實驗鋪板時，為避免“邊緣效應(yīng)”，以應(yīng)用96孔板的中間60孔為zui佳，一般四周的一圈邊緣孔不養(yǎng)細(xì)胞，只做空白或陰性對照。

鋪板時，細(xì)胞懸液一定要混勻，以避免細(xì)胞沉淀下來而導(dǎo)致每孔中的細(xì)胞數(shù)量不等，可以每接幾個就再混勻一下。

加樣器操作要熟練，盡量避免人為誤差。此外，吹散次數(shù)過多也會影響細(xì)胞活力。所以要熟練操作，盡快上板。

何時選擇使用熱滅活血清

加熱血清可以滅活補體系統(tǒng)。

啟動的補體參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺，啟動淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活化。

在免疫學(xué)研究、培養(yǎng)ES細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時，推薦使用熱滅活血清。

熱滅活血清可能出現(xiàn)的現(xiàn)象

在免疫學(xué)研究、培養(yǎng)ES細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時，推薦使用熱滅活血清。

而對于其他大多數(shù)的細(xì)胞來說是不需要熱滅活血清的。

熱滅活血清對細(xì)胞的生長只有微小的促進(jìn)，或*沒有任何作用，甚至可能因為高溫處理影響了血清的質(zhì)量，而造成細(xì)胞生長速率的降低；經(jīng)過熱處理的血清，沉淀物會顯著地增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是“小黑點”，常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37度環(huán)境中，又會使此沉淀物增多，使研究者誤認(rèn)為是微生物的分裂擴(kuò)增。

您可以根據(jù)您的研究需要選擇是否需要熱滅活血清。

如此一來，不但能確保血清的質(zhì)量，而且能夠節(jié)省您寶貴的時間。

如何正確熱滅活血清

熱滅活時請將血清置于56℃水浴30分鐘。

為盡量減少熱滅活對血清品質(zhì)的影響，一次滅活的血清體積不宜過大。

zui好準(zhǔn)備同樣的容器裝相等體積的水（與血清相同溫度），滅活時將裝有血清和水的容器同時放入56℃水浴，在裝水的容器中放置溫度計，加熱過程中不時地輕輕旋轉(zhuǎn)混勻血清，當(dāng)溫度計顯示達(dá)到56℃左右，開始計時。

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