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免疫組化

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主要操作步驟：
1.        洗載玻片:將載玻片置于重鉻酸鉀和濃H2SO4混合液中,目的是為了是載玻片上的硅膠等除去,同時(shí)使一些肉眼看不見(jiàn)的凹凸不平的表面變平整,便于組織吸附,然后置于清水中清洗,除去殘余的重鉻酸鉀和濃H2SO4(大約沖一個(gè)小時(shí)左右),再將載玻片浸泡于酒精之中, 然后放到架子上,置于37°C溫箱中，將多聚賴(lài)氨酸涂布于玻片的表面，由于Lys帶正電，而大多數(shù)的組織帶負(fù)電荷，從而產(chǎn)生吸附作用。
2.        包埋組織:先在鐵模具中加入一些液態(tài)石蠟，先稍微冷卻，然后再將待包埋的組織置于石蠟之中，并排列整齊，再將塑料模具盒蓋上，zui后加入少許液體石蠟，進(jìn)行冷凍，使石蠟變成固態(tài)。
3.        切片：將包埋好的組織從模具上取下來(lái)，并置于石蠟切片機(jī)上，切片機(jī)通過(guò)調(diào)節(jié)上下左右來(lái)來(lái)使組織和切割方向*，然后調(diào)節(jié)切片的厚度，一般為5µm,如果比較難切，則可以適當(dāng)調(diào)整厚度，用毛筆將切割的載玻片向外拉，并用小鑷子將包含有完整組織的載玻片置于40°C溫水中。
4.        撈組織：當(dāng)組織載玻片置于40°C溫水中之前，要先將水浴中的氣泡趕走，以免氣泡受熱上浮而貼到組織上，組織受熱展開(kāi)，是組織不起皺紋，用載玻片撈組織時(shí)，一般取載玻片的下1/3或者下1/2一般每種組織撈5-6張，其中2-3張是備用的，每張載玻片上通常撈兩份組織，做對(duì)照使用，這樣形成的誤差就比較小了，而且撈載玻片的時(shí)候方向*，以便觀(guān)察，再將撈出來(lái)的載玻片置于架子上，放入37°C溫箱中烘干。
5.        脫蠟：依次將載玻片放入二甲苯-二甲苯-*酒精-*酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，起脫蠟作用的主要是二甲苯,依據(jù)的是相似相溶的原理.一般在每個(gè)試劑中放10min,天氣熱可以少放幾分鐘,相反,天氣較冷的話(huà),就要適當(dāng)延長(zhǎng)脫蠟時(shí)間,一般為12-15min.
6.        抗原修復(fù)：脫蠟后在清水中沖洗一段時(shí)間，加入3%H2O2浸泡10min，從而除去內(nèi)源性的過(guò)氧化氫酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗兩次，再加入檸檬酸緩沖液，放入微波爐中蒸煮3min（中火），一般剛到沸騰即可，冷卻至室溫，然后再蒸煮一次，冷卻至室溫，蒸煮的目的是為了使抗原的位點(diǎn)暴露出來(lái)。
7.        血清封閉：冷卻至室溫后，將檸檬酸緩沖液倒掉，水洗2次，并將載玻片置于PBS中5min，洗2次，擦干組織周?chē)腜BS液，馬上加上血清，使一些非特異性的位點(diǎn)封閉起來(lái)，然后放入37°C溫箱中半小時(shí)。血清稀釋10倍（900µlPBS：100µl血清封閉液）。
8.        加一抗：將溫箱中的載玻片取出，用吸水紙擦干載玻片反面和正面組織周?chē)难澹右豢?，如果做?duì)照實(shí)驗(yàn)，就在對(duì)照的組織上加PBS。加完一抗后于4°C冰箱中保存過(guò)一夜。
9.        加二抗：將載玻片從冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周?chē)腜BS后加上二抗,然后置于37°C溫箱中半小時(shí)。
10.        加SABC:將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周?chē)腜BS后加上SABC, 然后置于37°C溫箱中半小時(shí)。SABC稀釋100倍（990µlPBS：10µlSABC）。
11.        加顯色劑：將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周?chē)腜BS后加上顯色劑。（顯色劑的配置：在1ml水中加1滴顯色劑A，搖勻，然后加1滴顯色劑B，搖勻，再加1滴顯色劑C，搖勻）   A：DAB        B：H2O2        C：磷酸緩沖液
12.        復(fù)染：將顯色后的片子用清水沖洗一段時(shí)間后，浸泡于蘇木精中染色，一般動(dòng)物組織為半分鐘，植物組織3-5min。
13.        脫水：將復(fù)染后的片子置于水中沖洗后，依次將載玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-*酒精-*酒精-二甲苯-二甲苯。每個(gè)試劑中放置2min，zui后浸泡在二甲苯中，搬到通風(fēng)柜中。
14.        封片：用中性樹(shù)膠滴在組織旁邊，再用蓋玻片蓋上，要先放平一側(cè)，然后輕輕放下另一側(cè)，以免產(chǎn)生氣泡，封好片子后置于通風(fēng)柜中晾干。

注意事項(xiàng)：

切片組織得到很好處理后在進(jìn)行切片之前還應(yīng)對(duì)玻璃片進(jìn)行處理，由于我們檢測(cè)抗原是多種多樣的，因染色操作程序復(fù)雜，時(shí)間較長(zhǎng)，有些抗原是要進(jìn)行各種抗原修復(fù)處理，如微波、高壓、水溶酶等，玻片如果得不到很好的處理，將易造成脫片，為保證實(shí)驗(yàn)的正常進(jìn)行，要求在貼片前對(duì)載玻片作適當(dāng)處理，必須在清洗干凈的玻片上進(jìn)行粘合劑的處理以防脫片。
1)Poly-L-Lysine 
一般采用分子量30000左右的0.5%多聚賴(lài)氨酸，也可用試劑公司出售的其濃溶液以1：10去離子水稀釋。方法是將玻片浸泡其中，傾盡余液，在60℃溫箱中烤干備用，此方法的優(yōu)點(diǎn)是可以用于多種組織化學(xué)、及分子學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用，粘貼效果，但價(jià)格稍貴。
2)明膠硫酸鉻鉀法
將2.5g明膠加熱溶于500ml蒸餾水中，*溶解冷卻后加入0.25g硫酸鉻鉀攪勻充分溶解即可使用。方法是將玻片浸泡其中2 min，取出控盡液體入溫箱中烤干備用。此法價(jià)格便宜、方法簡(jiǎn)單，任何實(shí)驗(yàn)都可以使用，特別適用于大批量的使用，但應(yīng)注意，如果液體變藍(lán)或粘稠狀停用。
3)APES (3-氨丙基-乙氧基甲硅烷)
此法必須現(xiàn)用現(xiàn)配。將洗凈玻片入1:50丙酮稀釋的APES中，浸泡20s，取出稍停再入丙酮或蒸餾水中刷去末結(jié)合的APES晾干即可。用此方法粘合的玻片應(yīng)垂直烤片不能平拷，否則組織片中易出現(xiàn)氣泡。
切片必須保持切片刀銳利，切片要薄而平整、無(wú)皺摺、無(wú)刀痕，如有上述問(wèn)題的切片在進(jìn)行染色都將出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象，切片厚度一般為3~4μm，切好的切片在60℃溫箱中過(guò)一夜，注意烤片的溫度不宜過(guò)高，否則易使組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，而產(chǎn)生抗原標(biāo)記定位彌漫現(xiàn)象。