高脂樣本甘油檢測試劑盒（適用肝臟、脂肪細(xì)胞）

 描述：甘油是甘油三酯的水解產(chǎn)物。與游離脂肪酸一樣，甘油含量是甘油三酯水解反應(yīng)的可靠檢測指標(biāo)，但檢測更加方便。本試劑盒采用優(yōu)化步驟，能夠檢測實體組織、細(xì)胞中的甘油含量，線性范圍為10-1200µmol/L。

 原理：在ATP存在下甘油被甘油激酶磷酸化為3-磷酸甘油，再被甘油磷酸氧化酶氧化產(chǎn)生過氧化氫；在過氧化物酶作用下生色底物轉(zhuǎn)化為苯醌亞胺，其光密度值與甘油濃度成正比。

 適用范圍：測定實體組織、細(xì)胞中的甘油濃度。

 組成 (105次微板測定或30次1 ml比色杯測定)：

(1)    裂解液 100 ml   

(2)    R1試劑 16 ml

(3)    R2試劑  4 ml    

(4)    4 mmol/L甘油標(biāo)準(zhǔn)品1 ml

4 ºC保存  6個月有效

 所需設(shè)備：酶標(biāo)儀、生化分析儀或721、722型可見光分光光度計。佳工作波長550nm，如無此波長建議優(yōu)先選用570nm、次選530、490nm。

 一 組織細(xì)胞裂解

細(xì)胞(包括分化的脂肪細(xì)胞)裂解：

消化、離心收集細(xì)胞。或直接在培養(yǎng)皿內(nèi)裂解。通常6孔板單孔約2x10⁶個細(xì)胞，75cm²瓶約1x10⁷細(xì)胞。按比例每1~2 x 10⁶細(xì)胞加0.1ml裂解液，震蕩或渦旋裂解后，靜置10分鐘。

 動物組織裂解：

切記要預(yù)先將新鮮組織剪切稱重后再進(jìn)行保存。組織凍存后再進(jìn)行解凍、剪切、稱重可能會產(chǎn)生嚴(yán)重的測量誤差。離心管精確稱重，加入組織塊后再稱重，二者相減(即減量稱重法)計算組織重量(約100mg)。強(qiáng)烈建議按比例每1mg組織加10µl裂解液以減少樣品間蛋白和脂質(zhì)含量變異而產(chǎn)生的誤差。（注意；裂解液用量在1ml或更多可保證有效的裂解與脂質(zhì)提?。Ｓ秒妱痈咚賱驖{器或手動玻璃勻漿器破碎組織。（不超聲方法，因其不能*和均勻破碎。應(yīng)根據(jù)預(yù)實驗調(diào)整初始的組織細(xì)胞加入量），而后，靜置10分鐘。

 二. 裂解液處理：

1.    取適量上清液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，進(jìn)行步驟2的操作。余下的裂解液可用BCA法蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量或－20ºC儲存。

2.    70ºC 加熱10分鐘滅活脂肪酶，可能出現(xiàn)絮狀沉淀。

3.    室溫5000rpm離心5分鐘，上層清液即可用于酶學(xué)測定。

三 工作溶液配制：按4:1比例，取4 ml試劑R1與1 ml試劑R2混合即可，立即使用或4ºC保存<1天，變色棄去。（注意：謹(jǐn)防來源不明但容易發(fā)生的甘油污染，可來自操作者本人或標(biāo)準(zhǔn)品液體微粒濺射等。）

四 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：用蒸餾水、生理鹽水或與樣品緩沖液一致的液體，將4 mM甘油標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋為1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125 µmol/L，通常取其中4~6管即可，注意設(shè)置0濃度對照反應(yīng)管。

五 甘油測定

1.    參見下表加樣。待測樣品體積10µl，多加可能會抑制反應(yīng)。

2.    37ºC或25ºC反應(yīng) 10分鐘。反應(yīng)平衡后顏色在60分鐘內(nèi)穩(wěn)定。

3.    先用蒸餾水+工作液的空白管調(diào)零，然后測定各管OD值。

4.    繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算甘油濃度。

附Excel作圖步驟：各標(biāo)準(zhǔn)管OD值為y軸，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為x軸。(1)鼠標(biāo)左鍵圈住數(shù)據(jù)，點(diǎn)擊做圖向?qū)Вx擇-散點(diǎn)圖-，點(diǎn)擊-完成-。(2)鼠標(biāo)右鍵點(diǎn)圖上的某一點(diǎn)，點(diǎn)擊-添加趨勢線-，點(diǎn)擊-選項-，點(diǎn)擊-顯示公式-和-R²值-。

5.    以每mg蛋白濃度或細(xì)胞數(shù)校正甘油含量。

加樣表（可對樣品和工作液比例進(jìn)行微量調(diào)整）

說明：

1. 維生素C>0.18g/L、血紅蛋白>2g/L、膽紅素>0.25g/L、二硫蘇糖醇、巰基乙醇、高濃度EDTA干擾測試。

2. 紅細(xì)胞糖酵解時合成磷酸甘油影響測定。