己糖激酶(HK)活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書
紫外分光光度法
注意：正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定。
規(guī)格：50T/48S
產(chǎn)品內(nèi)容：
提取液：液體 60mL× 1
瓶，4℃保存；
試劑一：液體 30mL× 1
瓶，4℃保存；
試劑二：粉劑× 1 瓶，4℃保存； 臨用前加入 30mL 蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑 4℃保
存一周；
試劑三：液體 5 mL× 1 瓶，4℃保存；
試劑四：粉劑×1 支，- 20℃保存，用時(shí)每支加 4mL 雙蒸水充分溶解備用，用不完的試劑 4℃保
存一周；
試劑五：粉劑×1 支，- 20℃保存；用時(shí)每支加 2mL 雙蒸水充分溶解備用，用不完的試劑 4℃保
存一周；
試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存；用時(shí)每支加 250μL 試劑一和 250μL 蒸餾水充分溶解備用，用
不完的試劑 4℃保存一周；
產(chǎn)品說(shuō)明：
HK 廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是葡萄糖分解過(guò)程中的第一個(gè)關(guān)鍵酶，催
化葡萄糖轉(zhuǎn)化為 6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途徑的交叉點(diǎn)。
HK 催化葡萄糖合成 6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脫氫酶進(jìn)一步催化 6-磷酸葡萄糖脫氫生成
NADPH ，NADPH 在 340nm 有特征吸收峰。
試驗(yàn)中所需的儀器和試劑：
紫外分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸
餾水。
操作步驟：
一、樣品測(cè)定的準(zhǔn)備：
1.
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：
提取液體積（mL）為 500-1000:1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破
碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次），8000g 4℃離心 10min，
取上清，置冰上待測(cè)。
2.
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為 1:5-10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入
1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。
3.
血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。
二、測(cè)定操作：
1. 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。第 2頁(yè)，共 2 頁(yè)
2.將試劑一、二、三、四和五置于 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其他物種）預(yù)熱 10min。
3.加樣表
試劑名稱(μL) 測(cè)定管
試劑一 400
試劑二 400
試劑三 80
試劑四 80
試劑五 40
試劑六 8
樣本 30
將上述試劑按順序加入 1mL 石英比色皿中，立即混勻，加樣本的同時(shí)開始計(jì)時(shí)，在 340nm 波長(zhǎng)下
記錄 20 秒時(shí)的初始吸光度 A1，比色后迅速將比色皿連同反應(yīng)液一起放入 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃
（其它物種）水浴或恒溫箱中，準(zhǔn)確反應(yīng) 5 分鐘；迅速取出比色皿并擦干，340 nm 下比色，記錄 5
分 20 秒時(shí)的吸光度 A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。
注意事項(xiàng)：
1.如果一次性測(cè)定樣本數(shù)較多，可將試劑一、二、三、四、五、六按比例配成混合液，預(yù)熱 10min。
2.比色皿中反應(yīng)液的溫度必須保持37℃或25℃，取小燒杯一只裝入一定量的37℃或25℃蒸餾水，將此燒杯放入37℃或25℃水浴鍋中。在反應(yīng)過(guò)程中把比色皿連同反應(yīng)液放在此燒杯中。
3.zui好兩個(gè)人同時(shí)做此實(shí)驗(yàn)，一個(gè)人比色，一個(gè)人計(jì)時(shí)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
4.不同勻漿組織中 HK 活力不一樣，做正式試驗(yàn)之前請(qǐng)做 1- 2 只預(yù)試，若ΔA> 0.5，則說(shuō)明組織
活力太高，必須用提取液稀釋成適當(dāng)濃度勻漿上清液（計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)），或縮
短反應(yīng)時(shí)間至 2min，使ΔA< 0.5，以提高檢測(cè)靈敏度。
HK 活性計(jì)算：
1、 血清（漿）HK 活力的計(jì)算：
單位的定義：每毫升血清（漿）在每分鐘生成 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。
HK（U/mL）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷V 樣÷T=1113×ΔA
2、 組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 HK 活力計(jì)算：
（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。
HK（U/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1113×ΔA÷Cpr
（2） 按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每 g 組織每分鐘生成 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。
HK（U/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T=1113×ΔA÷W
（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。
HK（U/104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=2.226×ΔA
V 反總：反應(yīng)體系總體積，1.038×10-3 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：
比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.03 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)
間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。
