BD品牌 流式抗體細(xì)胞亞群研究試劑 mouse篇

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BD Pharmingen流式實(shí)驗(yàn)方案試劑精選

BD Pharmingen為您提供輕松上手的實(shí)驗(yàn)方案

常用Mouse Panel：

以561835為例：RM4-5單克隆抗體與大多數(shù)胸腺細(xì)胞、成熟T淋巴細(xì)胞亞群（即MHCⅡ類限制性T細(xì)胞，包括大多數(shù)輔助性T細(xì)胞和免疫抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞）和NK-T細(xì)胞亞群表達(dá)的CD4（L3T4）分化抗原特異性結(jié)合。據(jù)報(bào)道，CD4還可在多能干細(xì)胞、骨髓和B淋巴細(xì)胞前體、胸腺內(nèi)淋巴細(xì)胞前體和脾臟樹突狀細(xì)胞亞群中檢測(cè)到。CD4在小鼠卵細(xì)胞質(zhì)膜上表達(dá)，參與卵細(xì)胞與MHCⅡ類精子的粘附。CD4是T細(xì)胞表面的抗原受體，與抗原提呈細(xì)胞上MHCⅡ類分子相互作用。它通過(guò)與T細(xì)胞受體復(fù)合物和蛋白酪-氨酸激酶lck的結(jié)合參與T細(xì)胞活化。純化的RM4-5單抗已被報(bào)道能阻斷FITC結(jié)合的抗小鼠CD4克隆GK1.5和H129.19的結(jié)合，但不能阻斷RM4-4克隆。異硫氰酸熒光素FITC是一種分子量為389da的熒光色素。FITC對(duì)pH值變化和光漂白反應(yīng)敏感。由于幾乎相同的激發(fā)和發(fā)射特性，但溢出特性不同，F(xiàn)ITC和Alexa Fluor®488不能同時(shí)使用。FITC相對(duì)較暗，應(yīng)盡可能保留高表達(dá)標(biāo)記。

準(zhǔn)備和儲(chǔ)存

用親和層析法從組織培養(yǎng)上清或腹水中純化單克隆抗體。在條件下將抗體與FITC偶聯(lián)，去除未反應(yīng)的FITC。在4°C下未稀釋儲(chǔ)存，并防止長(zhǎng)期暴露在光下。不要凍僵。

由于應(yīng)用不同，每位研究者應(yīng)滴定試劑以獲得結(jié)果。

抗體通過(guò)流式細(xì)胞儀分析進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)。其他應(yīng)用在BD生物科學(xué)制藥公司僅在抗體開發(fā)期間進(jìn)行測(cè)試或在文獻(xiàn)中報(bào)告。

BD公司™ CompBeads可以作為替代物來(lái)評(píng)估熒光溢出（補(bǔ)償）。當(dāng)熒光色素結(jié)合抗體與復(fù)合珠結(jié)合時(shí)，它們具有與細(xì)胞非常相似的光譜特性。然而，對(duì)于某些熒光色素，與細(xì)胞相比光譜發(fā)射可能存在微小差異，從而導(dǎo)致溢出值與生物控制相比有所不同。強(qiáng)烈建議用戶在*使用試劑時(shí)，比較細(xì)胞溢出和Comp珠，以確保BD Comp珠適合您的特定細(xì)胞應(yīng)用。

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為獲得jia結(jié)果，建議在抗體染色后進(jìn)行兩次清洗。在流式細(xì)胞儀上采集細(xì)胞之前，可制備細(xì)胞，用抗體染色，并用洗滌緩沖液洗滌兩次，以進(jìn)行免疫熒光染色。執(zhí)行少于建議的清洗步驟可能導(dǎo)致陰性人群的傳播增加。

為了獲得jia和可重復(fù)的結(jié)果，在同一實(shí)驗(yàn)中使用兩種或兩種以上的BD-Horizon亮色染料時(shí)，應(yīng)使用BD-Horizon亮色緩沖液。熒光染料相互作用可能導(dǎo)致染色偽影，從而影響數(shù)據(jù)解釋。BD-Horizon亮斑緩沖液的設(shè)計(jì)是為了小化這些相互作用。更多信息可以在BD Horizon Brilliant染色緩沖液（Cat）的技術(shù)數(shù)據(jù)表中找到。

此篇為您提供流式抗體細(xì)胞亞群研究試劑 human篇，用于人體細(xì)胞亞群的研究試劑

產(chǎn)品名稱：BD品牌 流式抗體細(xì)胞亞群研究試劑 mouse篇

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   流式細(xì)胞技術(shù)
流式細(xì)胞術(shù)工作原理是在細(xì)胞分子水平上通過(guò)單克隆抗體對(duì)單個(gè)細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行多參數(shù)、快速的定量分析。它可以高速分析上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，并能同時(shí)從一個(gè)細(xì)胞中測(cè)得多個(gè)參數(shù)，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好的優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)代xian進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)之一。
光源、液流通路、信號(hào)檢測(cè)傳輸和數(shù)據(jù)的分析系統(tǒng)是流式細(xì)胞儀的主要組成。目前臨床中運(yùn)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行外周血白細(xì)胞、骨髓細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞等的檢測(cè)是臨床檢測(cè)的重要組成部分。流式細(xì)胞技術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）是利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行的一種單細(xì)胞定量分析和分選技術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)是單克隆抗體及免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、激光和電子計(jì)算機(jī)科學(xué)等高度發(fā)展及綜合利用的高技術(shù)產(chǎn)物。1.使各種液體和懸浮細(xì)胞樣本新鮮，盡快完成樣本制備和檢測(cè)；2.針對(duì)不同的細(xì)胞樣本進(jìn)行適當(dāng)洗滌、酶消化或EDTA處理，以清除雜質(zhì)，使粘附的細(xì)胞彼此分離而形成單細(xì)胞狀態(tài)；3.對(duì)新鮮實(shí)體瘤組織可選用或聯(lián)用酶消化法，機(jī)械打散法和化學(xué)分散法來(lái)獲得足夠數(shù)量的單細(xì)胞懸液；4.對(duì)石蠟包埋組織應(yīng)先切成若干40-50um厚的蠟片，經(jīng)二甲苯脫蠟到水后，再用前述方法制備單細(xì)胞懸液；5.單細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)不應(yīng)少于10000個(gè)。
流式細(xì)胞技術(shù)的應(yīng)用：
1.其測(cè)定細(xì)胞內(nèi)DNA的變異系數(shù)小，一般在2%以下；
2.能準(zhǔn)確地進(jìn)行DNA倍體分析；
3.借助于熒光染料進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸的定量研究；
4.快速進(jìn)行細(xì)胞分選和細(xì)胞收集；
5.醫(yī)學(xué)應(yīng)用：免疫功能研究各種干細(xì)胞的檢測(cè)，癌癥病人的多藥耐藥性，細(xì)胞功能及代謝動(dòng)力學(xué)研究，血小板分析（心血管疾?。魇郊?xì)胞術(shù)與分子生物學(xué)研究；
6 應(yīng)用于外周血內(nèi)皮細(xì)胞測(cè)定、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等領(lǐng)域。用于臨床
流式細(xì)胞分析儀臨床用于細(xì)胞治療中心在FACSVantage革命化的細(xì)胞分選功能基礎(chǔ)上推出的分選增強(qiáng)（Sort Enhanced edition，SE），BD FACSVantage SE，其新功能和新配置通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)多激光多熒光系統(tǒng)以及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)的完-美整合，速度更快，功能更強(qiáng)，是當(dāng)今流式技術(shù)的體現(xiàn)。
當(dāng)前，臨床流式細(xì)胞分析已成為檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)發(fā)展的一個(gè)熱點(diǎn)，其發(fā)展趨勢(shì)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。
一．從相對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)到細(xì)胞計(jì)數(shù)
流式細(xì)胞分析大的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)混合細(xì)胞群體中亞群細(xì)胞的計(jì)數(shù)，如淋巴細(xì)胞可依其表面標(biāo)志的不同分為T淋巴細(xì)胞（CD3+）、B淋巴細(xì)胞（CD19+）、NK細(xì)胞（CD16+56+/CD3-），T淋巴細(xì)胞又可進(jìn)一步分為輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞（CD3+CD4+CD8-）和抑制/細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（CD3+CD4-CD8+）等。這些亞群細(xì)胞計(jì)數(shù)過(guò)去多以相對(duì)百分比表達(dá)結(jié)果，由于百分比只能代表每種細(xì)胞在混合細(xì)胞群體中所占的比例，并不能體現(xiàn)其在單位體積血液中的數(shù)量，而對(duì)艾滋病等一些疾病的臨床診斷，有時(shí)需要考慮細(xì)胞的數(shù)量，如患者血液中T輔助/誘導(dǎo)細(xì)胞（CD3+CD4+CD8-）的數(shù)量<200個(gè)>200個(gè)/μL。T淋巴細(xì)胞亞群的計(jì)數(shù)在國(guó)外實(shí)驗(yàn)室早已成為常規(guī)檢查，但在國(guó)內(nèi)僅有少數(shù)實(shí)驗(yàn)室開展。可以預(yù)見，隨著干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，對(duì)造血干細(xì)胞等的數(shù)量分析，不久的將來(lái)，也將作為常規(guī)檢查項(xiàng)目，走出實(shí)驗(yàn)室進(jìn)入臨床。
流式細(xì)胞計(jì)數(shù)在臨床可開展的項(xiàng)目包括：①淋巴細(xì)胞亞群，尤其是T淋巴細(xì)胞亞群的計(jì)數(shù)。②外周血或骨髓中造血干/祖細(xì)胞的計(jì)數(shù)。③血液中網(wǎng)織紅細(xì)胞的計(jì)數(shù)。④血液中血小板數(shù)量，尤其是血小板減少癥患者血小板的計(jì)數(shù)，此種計(jì)數(shù)優(yōu)于血細(xì)胞-分析儀法，已成為血小板計(jì)數(shù)的推薦參考方法。此外，可能出現(xiàn)在血液中的其它一些稀少細(xì)胞（如內(nèi)皮細(xì)胞、轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞等）的計(jì)數(shù)，也將發(fā)展為流式細(xì)胞計(jì)數(shù)。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)的開展對(duì)臨床疾病的診斷、治療等有重要意義。
二．從相對(duì)定量到定量分析
細(xì)胞的多種成分如某些抗原或受體表達(dá)的流式細(xì)胞分析，以前多以平均熒光強(qiáng)度（MFI）或相對(duì)熒光強(qiáng)度（RFI）表達(dá)其含量。由于流式細(xì)胞儀每次的儀器狀況可出現(xiàn)差異，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室所用儀器的類型也不盡相同，因此，以MFI或RFI表示細(xì)胞抗原或受體的表達(dá)量缺乏可比性，雖然流式細(xì)胞儀有*的熒光靈敏度，但卻無(wú)法準(zhǔn)確應(yīng)用這些信息。近年來(lái)，為了通過(guò)FCM精確定量分析細(xì)胞的某些成分，定量流式細(xì)胞術(shù)（Quantitative Flow Cytometry，QFCM）逐漸得到發(fā)展，其定量分析原理主要有兩種：①定量抗體微球法：在特制的微球上包被已知分子數(shù)的羊抗鼠IgG分子，再將包被不同分子數(shù)的微球混合，形成含不同羊抗鼠IgG分子數(shù)的混合微球，此微球與待測(cè)標(biāo)本在相同條件下與熒光素標(biāo)記的單克隆抗體（McAb）反應(yīng)后在流式細(xì)胞儀上測(cè)定其熒光強(qiáng)度，根據(jù)微球上所包被的羊抗鼠IgG分子數(shù)和與之對(duì)應(yīng)的對(duì)數(shù)熒光強(qiáng)度計(jì)算回歸方程，再將待測(cè)樣本中陽(yáng)性細(xì)胞的對(duì)數(shù)熒光強(qiáng)度代入方程即可求得其每個(gè)細(xì)胞上的平均抗原分子數(shù)（抗原結(jié)合位點(diǎn)數(shù)）。②定量熒光素分子微球法：在特制的微球上直接包被熒光素分子，再將包被不同分子數(shù)的微球混合，形成含不同數(shù)量熒光素分子的混合微球。
三．從單色到多色熒光分析
流式細(xì)胞分析已從初的間接免疫熒光染色、單色或雙色直接熒光染色，迅速發(fā)展到三色、四色甚至五色或六色熒光分析，使得對(duì)細(xì)胞亞群的識(shí)別和分選、細(xì)胞功能評(píng)價(jià)等更為精確。目前，淋巴細(xì)胞亞群的分析、白血病免疫表型分析，均應(yīng)使用至少三色以上的熒光分析才更可靠。例如：輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞四色熒光分析的免疫表型為CD3+CD4+CD8—CD45+，慢性淋巴細(xì)胞白血病的異常淋巴細(xì)胞的四色免疫表型為CD5+CD10—CD19+CD45+。多色熒光分析是流式細(xì)胞技術(shù)發(fā)展的必然趨勢(shì)，有條件時(shí)應(yīng)盡可能地采用。
四．從細(xì)胞膜成份到細(xì)胞內(nèi)成份分析
細(xì)胞膜免疫表型分析是重要的流式分析內(nèi)容之一，很多細(xì)胞亞群的檢測(cè)和分選均是以細(xì)胞膜的免疫表型特征為依據(jù)，如T、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞分析、白血病免疫分型等。然而，僅有膜免疫表型的分析是不夠的，尤其對(duì)一些細(xì)胞的系列鑒定和功能狀態(tài)分析常常較為困難，而細(xì)胞漿或細(xì)胞核內(nèi)成份的分析則更能反映某些細(xì)胞的系列特征和功能變化。隨著近年來(lái)細(xì)胞內(nèi)成分檢測(cè)技術(shù)的不斷完善，細(xì)胞內(nèi)成分檢測(cè)已成為流式細(xì)胞分析的又一個(gè)熱點(diǎn)。例如，急性髓系白血病性原始細(xì)胞漿中檢測(cè)到髓過(guò)氧化物酶（MPO）是zui為準(zhǔn)確的系列標(biāo)志，急性B淋巴細(xì)胞白血病性原始細(xì)胞胞漿中檢測(cè)到CD79a是zui為特異的系列標(biāo)志；檢測(cè)T淋巴細(xì)胞胞漿內(nèi)細(xì)胞因子合成的種類及含量和膜CD69分子表達(dá)，是判斷T淋巴細(xì)胞活化及其功能的重要手段，而且還能將輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞（Th）進(jìn)一步分成Th1和Th2亞類，在Th1和Th2細(xì)胞漿中可分別合成γ-干擾素（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）和IL-4、IL-5、IL-10。通過(guò)細(xì)胞內(nèi)成分檢測(cè)技術(shù)與多色免疫熒光分析方法相結(jié)合，可檢測(cè)不同細(xì)胞亞群合成的不同細(xì)胞因子（Cytokine），如用五色疫熒光分析血液中淋巴細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)劑刺激后，輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞亞類—Th1細(xì)胞內(nèi)有細(xì)胞因子合成的免疫表型為CD3+CD4+CD8—IFN-γ+IL-1+。
五．液體中可溶性成分的流式細(xì)胞分析
從傳統(tǒng)意義上講，流式細(xì)胞技術(shù)只能分析細(xì)胞及其成分，液體中的可溶性成分則不能進(jìn)行分析。然而，如果將液體中的可溶性成分結(jié)合在一種類似于細(xì)胞大小的顆粒（如乳膠顆粒）上，流式細(xì)胞儀便可以對(duì)其進(jìn)行分析，這就是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的流式微球分析（Cytometric Bead Assay，CBA）技術(shù)。CBA的原理是將包被某種抗原或抗體不同大小的微球與待測(cè)液體中的相應(yīng)成分反應(yīng)形成抗原與抗體的復(fù)合物，再加入熒光素標(biāo)記的第二抗體，微球上結(jié)合的待測(cè)抗原或抗體分子數(shù)量與其熒光強(qiáng)度呈線性關(guān)系，由此可對(duì)待測(cè)液體中與微球上包被抗原或抗體分子相對(duì)應(yīng)的成分進(jìn)行定性或定量分析，例如同時(shí)測(cè)定血清或細(xì)胞培養(yǎng)液中的多種細(xì)胞因子，同時(shí)測(cè)定血清中多種自身抗體。CBA發(fā)展的時(shí)間雖很短，目前所能檢測(cè)的項(xiàng)目還不多，但其發(fā)展?jié)摿Σ蝗莺鲆?。已知檢測(cè)細(xì)胞因子的方法有多種，包括靶細(xì)胞功能分析法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、斑點(diǎn)酶免疫分析（Elispots）等，但CBA與之相比，其靈敏度*、可達(dá)2pg/ml，而且能同時(shí)測(cè)定單個(gè)標(biāo)本中的多種細(xì)胞因子。

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