膀胱癌（BCa）是全球診斷出的第shi;da癌癥，可分為非肌層浸潤性膀胱癌和肌層浸潤性膀胱癌。gen;zhi性膀胱切除術(shù)是非轉(zhuǎn)移性肌層浸潤性膀胱癌（MIBC）患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，無需新輔助化療，但其復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率很高。因此，明確膀胱癌進(jìn)展的機(jī)制，尋找膀胱癌治療的新靶點(diǎn)尤為重要。

最近，免疫療法已被用于治療多種癌癥，但仍遠(yuǎn)不能滿足臨床需求。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）是腫瘤微環(huán)境（TME）中免疫細(xì)胞的主要成分，被認(rèn)為在腫瘤進(jìn)展中起核心作用。越來越多的證據(jù)表明，TAM可以通過馴化宿主適應(yīng)性免疫來增加腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。有研究認(rèn)為，對TAM進(jìn)行腫瘤殺傷能力的再調(diào)控可能有助于膀胱癌治療。因此，迫切需要了解腫瘤進(jìn)展過程中TAM在膀胱TME中的極化情況。

新出現(xiàn)的證據(jù)表明，腫瘤細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間的通訊在介導(dǎo)TAM極化中起著關(guān)鍵作用。源自腫瘤細(xì)胞的信號，如轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β），可促進(jìn)未活化的巨噬細(xì)胞分化為TAM樣免疫抑制表型，其特征是抗炎細(xì)胞因子表達(dá)增加和促炎細(xì)胞因子表達(dá)減少。外泌體是細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞外囊泡，其主要成分是磷脂雙分子層和攜帶相關(guān)內(nèi)容，并介導(dǎo)細(xì)胞之間的信息傳遞和物質(zhì)交換。因此，外泌體有助于TME中腫瘤細(xì)胞與其他基質(zhì)或免疫細(xì)胞之間的信息和物質(zhì)交換。據(jù)報道，源自TAM的外泌體可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移以及對化療的耐藥性。相反，膀胱癌細(xì)胞T24細(xì)胞分泌的外泌體miR-21可以通過激活PI3K-AKT-STAT3信號通路將THP-1細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞極化為M2表型。然而，腫瘤細(xì)胞衍生外泌體介導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化的潛在機(jī)制仍未wan;quan了解。

在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科課題組的一項研究中，曾探討了膀胱腫瘤細(xì)胞衍生的外泌體如何誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化以及對腫瘤生長的影響。實(shí)驗首先研究了小鼠膀胱細(xì)胞MB49來源的外泌體對骨髓來源巨噬細(xì)胞（BMDM）極化的影響，以及MB49來源的外泌體刺激巨噬細(xì)胞對T細(xì)胞增殖的影響，此外還研究了GW4869通過抑制外泌體的產(chǎn)生或釋放對膀胱癌生長的潛在治療功能。具體研究成果以“Cancer derived exosomes induce macrophages immunosuppressive polarization to promote bladder cancer progression"為題發(fā)表在 Cell Communication and Signaling volume 期刊。

首先，為研究膀胱癌細(xì)胞分泌因子對巨噬細(xì)胞極化的影響，采用MB49細(xì)胞（小鼠膀胱癌細(xì)胞）培養(yǎng)上清液處理小鼠BMDM，分析基因表達(dá)。M2相關(guān)基因的表達(dá)，包括白細(xì)胞介素-10（Il-10），Cd206和轉(zhuǎn)化生長因子β（Tgfb）增加，而M1基因 iNOS 表達(dá)降低。MB49細(xì)胞培養(yǎng)上清液介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M2極化通過F4/80+ CD206+ 巨噬細(xì)胞群的增加進(jìn)一步得到驗證。這些結(jié)果表明，MB49細(xì)胞條件培養(yǎng)基（CM）可以促進(jìn)BMDM向M2表型的極化。

然后研究了MB49細(xì)胞CM中的外泌體是否可以介導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化。通過電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài)（圖1 A），并檢測了外泌體標(biāo)志物HSP90和CD63的表達(dá)（圖1 A）。為了研究巨噬細(xì)胞是否可以攝取MB49衍生的外泌體，將BMDM與Cy5.5標(biāo)記的外泌體進(jìn)行共培養(yǎng)。免疫熒光和流式細(xì)胞分析表明，MB49來源的外泌體可以被巨噬細(xì)胞攝?。▓D1 C、D）。進(jìn)而通過將Cy5.5標(biāo)記的MB49衍生外泌體注射到小鼠體內(nèi)研究了膀胱巨噬細(xì)胞中外泌體富集和吸收的可能性。結(jié)果顯示，膀胱F4/80+ CD11b+ 巨噬細(xì)胞中Cy5.5的平均熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)高于對照組（圖1 E）?；谏鲜鼋Y(jié)果，可以確認(rèn)源自MB49細(xì)胞的外泌體可以在體外和體內(nèi)被巨噬細(xì)胞攝取。

圖1   鑒定MB49衍生的外泌體及其在巨噬細(xì)胞中的攝取。

接下來，為了進(jìn)一步鑒定MB49來源外泌體對BMDM表型和功能的影響，檢測了MB49來源外泌體處理的BMDM中M1 / M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物的基因表達(dá)水平。結(jié)果顯示，MB49來源的外泌體刺激的BMDM中Il10、Cd206和Tgfb的表達(dá)顯著增加，而M1巨噬細(xì)胞基因 iNOS 的表達(dá)降低，這說明MB49來源的外泌體可以將巨噬細(xì)胞極化為M2表型。此外，通過利用外泌體抑制劑GW4869來檢測M1 / M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，進(jìn)一步確認(rèn)了M2巨噬細(xì)胞的極化是外泌體依賴性的。為了進(jìn)一步研究MB49來源的外泌體極化巨噬細(xì)胞的免疫抑制功能，將MB49來源的外泌體刺激的BMDM與CFSE標(biāo)記的脾臟T細(xì)胞共培養(yǎng)3天。MB49衍生的外泌體極化BMDM顯著降低了CD4+/CD8+ T 細(xì)胞的增殖，而GW4869處理逆轉(zhuǎn)了T細(xì)胞增殖的降低。這些結(jié)果表明，MB49 CM中的外泌體在將巨噬細(xì)胞極化為M2表型和免疫抑制功能中起主導(dǎo)作用。

進(jìn)一步地，研究人員想知道MB49衍生的外泌體誘導(dǎo)的免疫抑制巨噬細(xì)胞是否會影響體內(nèi)膀胱腫瘤細(xì)胞的生長。在建立的小鼠皮下腫瘤模型中，與DMSO處理組相比，GW4869處理組的異種移植腫瘤的腫瘤/體重比和生長速度顯著較小且較慢（圖2 A-C）。而且，腫瘤中大多數(shù)巨噬細(xì)胞是M2（F4/80+ CD206+）表型，GW4869處理顯著降低了M2巨噬細(xì)胞的百分比（圖2 D）。此外，GW4869處理組CD4+ 和CD8+ T 細(xì)胞的比例顯著更高（圖2 E）。這些結(jié)果表明，MB49來源的外泌體可以通過外泌體介導(dǎo)的免疫抑制TME促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長。

圖2   MB49衍生的外泌體促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長。

越來越多的證據(jù)表明，外泌體miRNA具有多種功能，如促進(jìn)腫瘤生長、侵襲、調(diào)節(jié)TME等。最后，為了進(jìn)一步闡明MB49衍生外泌體中的miRNA譜，進(jìn)行了微陣列分析。基于MB49衍生的外泌體miRNAs靶基因，通過KEEG分析鑒定出多種癌癥相關(guān)信號通路，如PI3K-AKT通路。由于PTEN是一種腫瘤抑制因子，并且負(fù)調(diào)節(jié)PI3K-AKT信號，因此鑒定了兩種miRNAs，miR-92b-3p和miR-1231-5p，它們可以靶向Pten mRNA位點(diǎn)。

在MB49來源外泌體刺激的BMDM中PTEN的表達(dá)降低（圖3 A）。因此，p-PI3K和p-AKT顯著上調(diào)（圖3 A）。值得注意的是，p-STAT3/6也在MB49衍生的外泌體刺激后30分鐘和1小時被激活，但潛在的機(jī)制需要進(jìn)一步研究。為了進(jìn)一步證實(shí)miR-1231-5p或miR-92b-3p在MB49衍生的外泌體中對PTEN的抑制，分別用miR-1231-5p模擬物或miR-92b-3p模擬物或MB49衍生外泌體的每種抑制劑刺激BMDM。結(jié)果觀察到，miR-1231-5p模擬物或miR-92b-3p模擬物處理明顯降低了PTEN蛋白水平，這與MB49衍生的外泌體刺激相當(dāng)。同樣，miR-1231-5p模擬物或miR-92b-3p模擬物處理增加了p-PI3K/p-AKT/p-STAT3/6 蛋白水平。此外，MB49衍生的外泌體介導(dǎo)的PTEN蛋白下調(diào)和p-PI3K/p-AKT/p-STAT3/6上調(diào)通過補(bǔ)充miR-1231-5p抑制劑或miR-92b-3p抑制劑逆轉(zhuǎn)（圖3 B）。這些數(shù)據(jù)表明，MB49衍生外泌體中所含的miR-1231-5p 和miR-92b-3p 在激活PTEN/AKT/STAT3/6通路中起關(guān)鍵作用。

基于上述結(jié)果，發(fā)現(xiàn)MB49來源的外泌體miRNAs可以通過激活PTEN/AKT/STAT3/6通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化為免疫抑制表型，從而有助于建立免疫抑制TME以促進(jìn)腫瘤生長。

圖3   MB49衍生的外泌體激活BMDM中的PTEN/AKT/STAT3/6信號通路。

圖4   圖形概要
MB49來源的外泌體可以被巨噬細(xì)胞攝取，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞免疫抑制極化。機(jī)制上，MB49衍生的外泌體誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化是通過PTEN的下調(diào)和AKT/STAT3/6信號的激活介導(dǎo)的。此外，在小鼠皮下腫瘤模型中，GW4869阻礙外泌體的產(chǎn)生或分泌可抑制巨噬細(xì)胞向免疫抑制表型和功能的分化，從而抑制腫瘤的生長。

綜上所述，該研究進(jìn)一步證實(shí)了膀胱癌細(xì)胞來源的外泌體有助于建立免疫抑制性TME并促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。外泌體miR-92b-3p和miR-1231-5p可能在AKT/STAT3/6信號通路的激活和誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞免疫抑制分化中起至關(guān)重要的作用。此外，GW4869對外泌體的產(chǎn)生或釋放的阻礙可以通過逆轉(zhuǎn)免疫抑制TME來抑制膀胱腫瘤細(xì)胞的生長。

參考文獻(xiàn)：Jiang Z, Zhang Y, Zhang Y, Jia Z, Zhang Z, Yang J. Cancer derived exosomes induce macrophages immunosuppressive polarization to promote bladder cancer progression. Cell Commun Signal. 2021 Sep 14;19(1):93. doi: 10.1186/s12964-021-00768-1. PMID: 34521440; PMCID: PMC8439012.

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