機(jī)械負(fù)荷已被證明可以調(diào)節(jié)骨重塑和體內(nèi)平衡。流體剪切應(yīng)力（FSS）是機(jī)械刺激的一種形式，可以激活許多信號(hào)通路并促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化。以往研究表明，生理性FSS（12 dyn/cm2）可通過ERK5 / AP-1，Gαq / ERK5和NFATc1 / ERK5信號(hào)通路促進(jìn)MC3T3-E1 成骨細(xì)胞的增殖作用，通過 ERK5-AKT-FoxO3a-Bim/FasL 信號(hào)通路抑制 MC3T3-E1 成骨細(xì)胞的凋亡作用。

MiRNAs已被證明參與調(diào)節(jié)骨形成。此外，一些miRNAs在成骨細(xì)胞增殖和分化過程中對(duì)機(jī)械刺激敏感，幾種miRNAs已被證實(shí)參與調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞凋亡，如miR-148a，miR-182-5p和miR-543。Mai 等人證明miR-34a下調(diào)可促進(jìn)FSS下的成骨細(xì)胞分化。然而，miR-34a是否能調(diào)節(jié)FSS下成骨細(xì)胞的增殖和凋亡，以及可能的機(jī)制還有待探索。

越來越多的證據(jù)表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNAs（lncRNAs）通過與miRNAs的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合來調(diào)控靶基因。LncRNAs也可調(diào)節(jié)成骨分化，例如，lncRNA MSC-AS1通過miR-140-5p促進(jìn)成骨分化。作為復(fù)雜的 lncRNA-miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一部分，lncRNAs 可影響骨質(zhì)疏松癥患者的骨形成和骨吸收。然而，lncRNAs在FSS下成骨細(xì)胞中的作用尚不清楚。

基于此，甘肅省蘭州大學(xué)第二醫(yī)院骨科的課題組曾研究了miR-34a在FSS下是否能調(diào)控成骨細(xì)胞增殖和凋亡及其可能的機(jī)制。研究結(jié)果揭示了lncRNA TUG1 / miR-34a / FGFR1軸在FSS調(diào)控的成骨細(xì)胞增殖和凋亡中的關(guān)鍵作用，并可能建立針對(duì)骨質(zhì)疏松癥的潛在治療策略。相關(guān)內(nèi)容發(fā)表在 Journal of Cellular and Molecular Medicine 雜志題為“Fluid shear stress regulates osteoblast proliferation and apoptosis via the lncRNA TUG1/miR-34a/FGFR1 axis"。

首先，mimic-34a 和 inhibitor-34a分別用于上調(diào)和下調(diào)MC3T3-E1細(xì)胞中miR-34a的水平。EdU 實(shí)驗(yàn)和 CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，上調(diào) miR-34a 可抑制細(xì)胞增殖，而下調(diào) miR-34a 可促進(jìn)細(xì)胞增殖。接下來，評(píng)估了miR-34a對(duì)成骨細(xì)胞凋亡的影響。流式細(xì)胞分析顯示，mimic-34a 轉(zhuǎn)染可顯著增加細(xì)胞凋亡率。Hoechst染色也表明，miR-34a的上調(diào)促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。這些數(shù)據(jù)表明，miR-34a的下調(diào)促進(jìn)了成骨細(xì)胞的增殖并抑制了細(xì)胞的凋亡。

qRT-PCR結(jié)果表明，miR-34a在FSS下持續(xù)下調(diào)，并在60 min時(shí)達(dá)到zui;di水平（圖1 A）。之前的研究表明，F(xiàn)SS促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖并抑制成骨細(xì)胞凋亡。為了研究miR-34a是否參與FSS調(diào)節(jié)的成骨細(xì)胞的增殖和凋亡，先使用 mimic-34a 轉(zhuǎn)染 MC3T3-E1 細(xì)胞，然后將 FSS（12 dynes/cm2）作用于細(xì)胞 0、30、60 或 90 min。結(jié)果表明，mimic-34a 轉(zhuǎn)染可顯著抑制 FSS 對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用（圖1 B-D）。另一方面，流式細(xì)胞分析顯示，mimic-34a 轉(zhuǎn)染可減弱 FSS 對(duì)成骨細(xì)胞凋亡率的降低作用（圖1 G）。這些結(jié)果表明，F(xiàn)SS對(duì)miR-34a的下調(diào)促進(jìn)了成骨細(xì)胞的增殖并抑制了成骨細(xì)胞的凋亡。

圖1    FSS 下調(diào) miR-34a 表達(dá)水平，miR-34a 上調(diào)削弱 FSS 下成骨細(xì)胞增殖和凋亡的改變。

接下來，為了研究FGFR1在成骨細(xì)胞增殖和凋亡中的功能，使用 pcDNA3.1-FGFR1過表達(dá) MC3T3-E1 細(xì)胞中的 FGFR1，siRNA-FGFR1 敲低 MC3T3-E1 細(xì)胞中的 FGFR1。結(jié)果顯示，pcDNA3.1-FGFR1 轉(zhuǎn)染可促進(jìn)細(xì)胞增殖，而 siRNA-FGFR1 轉(zhuǎn)染可抑制細(xì)胞增殖。此外，流式細(xì)胞分析顯示，與陰性對(duì)照相比，siRNA-FGFR1轉(zhuǎn)染組的凋亡率明顯上調(diào)。Hoechst染色也顯示，F(xiàn)GFR1沉默促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡。

為了確定FGFR1是否介導(dǎo)miR-34a調(diào)控的成骨細(xì)胞的增殖和凋亡，將 mimic-34a 和 pcDNA3.1-FGFR1 共轉(zhuǎn)染到 MC3T3-E1 細(xì)胞中。結(jié)果表明，過表達(dá) miR-34a 可抑制細(xì)胞增殖，而共轉(zhuǎn)染 mimi-34a 和pcDNA3.1-FGFR1 可減弱這種抑制作用（圖2 A、B）。共轉(zhuǎn)染 mimic-34a和 pcDNA3.1-FGFR1 可部分逆轉(zhuǎn)由上調(diào) miR-34a 引起的PCNA、CDK4 和 Cyclin D1 的 mRNA 和蛋白質(zhì)的下調(diào)作用（圖2 C、D）。此外，與 mimic-34a 轉(zhuǎn)染組相比，mimic-34a 和pcDNA3.1-FGFR1 共轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率更低（圖2 E）。Hoechst染色也表明，盡管 mimic-34a 可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但 pcDNA3.1-FGFR1 可抑制這種影響（圖2 F）。蛋白質(zhì)印跡進(jìn)一步證實(shí)，pcDNA3.1-FGFR1可減弱由 miR-34a 上調(diào)引起的 Bax 和 cleaved caspase-3 的增加，以及 Bcl-2 的降低（圖2 G）。這些結(jié)果表明，miR-34a至少部分通過調(diào)節(jié)MC3T3-E1細(xì)胞中的FGFR1發(fā)揮了抗增殖和促進(jìn)凋亡作用。

圖2   FGFR1介導(dǎo)miR-34a調(diào)節(jié)的成骨細(xì)胞增殖和凋亡。

然后，實(shí)驗(yàn)通過 TargetScan 和 StarBase 數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè) miR-34a 的靶基因。其中主要關(guān)注 FGFR1，它是已報(bào)到參與調(diào)控成骨細(xì)胞增殖和凋亡的 FGFR 家族成員之一。為了驗(yàn)證miR-34a 是否可直接靶向 FGFR1，構(gòu)建了熒光素酶報(bào)告載體（WT 和 MUT）。數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)GFR1 是 miR-34a 的直接靶點(diǎn)。

為了確認(rèn) FSS 對(duì) FGFR1 表達(dá)水平的影響，將 FSS 作用于 MC3T3-E1 細(xì)胞1小時(shí)。qRT-PCR 和蛋白質(zhì)印跡證實(shí)，F(xiàn)SS 可顯著增加 FGFR1 的 mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。此外，mimic-34a 僅可抑制 FSS 上調(diào)的 FGFR1 蛋白質(zhì)表達(dá)水平，而對(duì) FSS 上調(diào)的 FGFR1 mRNA 表達(dá)水平幾乎沒有影響。上述結(jié)果表明，在FSS下，miR-34a靶向MC3T3-E1細(xì)胞中的FGFR1。

此外，LncRNAs 通?？勺鳛?ceRNAs 通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合 miRNAs 來調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)。為了確認(rèn) miR-34a 是否受 lncRNA 調(diào)控，使用 StarBase 數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)了可以與 miR-34a 相互作用的 lncRNAs。在許多潛在靶點(diǎn)中，可參與調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞增殖和分化作用的 lncRNA TUG1 是一個(gè)重要的靶點(diǎn)。

為了研究 FSS 對(duì) lncRNA TUG1 表達(dá)水平的影響，將 FSS（12 dynes/cm2）作用于 MC3T3-E1 細(xì)胞 0、30、60 或 90 min。qRT-PCR結(jié)果表明，F(xiàn)SS 可顯著上調(diào) MC3T3-E1 細(xì)胞中 lncRNA TUG1 的表達(dá)水平（圖3 A），進(jìn)一步分析證實(shí)lncRNA TUG1定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中（圖3 B）。然后，發(fā)現(xiàn)miR-34a的上調(diào)可顯著抑制 lncRNA TUG1 的表達(dá)（圖3 C），敲低lncRNA TUG1可顯著增加miR-34a的表達(dá)（圖3 D）。為了驗(yàn)證lncRNA TUG1 是否可直接與 miR-34a 相結(jié)合，構(gòu)建了熒光素酶報(bào)告載體（WT 和 MUT ）（圖3 E）。結(jié)果顯示，上調(diào) miR-34a 可減弱 WT lncRNA TUG1 熒光素酶活性，下調(diào) miR-34a 可增強(qiáng) WT lncRNA TUG1熒光素酶活性，但對(duì) MUT lncRNA TUG1 的熒光素酶活性沒有影響（圖3 F）。這些結(jié)果表明，LncRNA TUG1 和 miR-34a 相互作用并相互抑制。

圖3    LncRNA TUG1 和 miR-34a 相互作用并相互抑制。

最后，通過lncRNA TUG1過表達(dá)和敲除實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了lncRNA TUG1對(duì)成骨細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控作用。結(jié)果表明，lncRNA TUG1 的過表達(dá)促進(jìn)了成骨細(xì)胞增殖。相反，lncRNA TUG1敲低抑制成骨細(xì)胞增殖。流式細(xì)胞分析表明，沉默lncRNA TUG1可提高細(xì)胞凋亡率。Hoechst染色也顯示siRNA-TUG1轉(zhuǎn)染促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

接下來，確認(rèn)了lncRNA TUG1是否調(diào)節(jié)FGFR1的表達(dá)。蛋白質(zhì)印跡顯示，lncRNA TUG1的過表達(dá)顯著增加FGFR1水平。相反，lncRNA TUG1敲低抑制了FGFR1蛋白的表達(dá)。此外，siRNA-TUG1和inhibitor-34a 在FSS作用前共轉(zhuǎn)染到MC3T3-E1細(xì)胞中，結(jié)果顯示，inhibitor-34a 轉(zhuǎn)染部分逆轉(zhuǎn)了FSS下siRNA-TUG1誘導(dǎo)的FGFR1蛋白質(zhì)表達(dá)水平的降低作用。這些結(jié)果表明，lncRNA TUG1通過靶向miR-34a/FGFR1通路促進(jìn)FSS下成骨細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡。

圖4    LncRNA TUG1/miR-34a/FGFR1 軸在成骨細(xì)胞中的作用示意圖。
在 FSS 作用下，MC3T3-E1 成骨細(xì)胞中 miR-34a 的表達(dá)水平下調(diào)，并可與上調(diào)的 lncRNA TUG1 相互作用。MiR-34a 的下調(diào)可通過靶向 FGFR1 促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖作用并抑制成骨細(xì)胞的凋亡作用。

總之，該研究證明了miR-34a在成骨細(xì)胞中響應(yīng)FSS而下調(diào)。miR-34a的下調(diào)通過靶向FGFR1促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖并抑制成骨細(xì)胞凋亡。此外，lncRNA TUG1通過吸附 miR-34a 上調(diào) FGFR1 的表達(dá)，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，抑制成骨細(xì)胞凋亡（圖4）。因此，研究結(jié)果揭示了lncRNA TUG1 / miR-34a / FGFR1軸在FSS調(diào)控的成骨細(xì)胞增殖和凋亡中的作用，并可能為骨質(zhì)疏松癥提供有希望的治療策略。

參考文獻(xiàn)：Wang X, He J, Wang H, Zhao D, Geng B, Wang S, An J, Wang C, Han H, Xia Y. Fluid shear stress regulates osteoblast proliferation and apoptosis via the lncRNA TUG1/miR-34a/FGFR1 axis. J Cell Mol Med. 2021 Sep;25(18):8734-8747. doi: 10.1111/jcmm.16829. Epub 2021 Aug 5. PMID: 34350720; PMCID: PMC8435422.

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