骨關(guān)節(jié)炎（OA）是最常見的慢性關(guān)節(jié)疾病，以關(guān)節(jié)軟骨的退行性變化和消失為特征。年齡、肥胖、代謝以及遺傳因素已被證明與OA的發(fā)生有關(guān)。過度的機械應(yīng)變是OA發(fā)生的必要因素，包括拉伸、剪切和應(yīng)變。在肥胖、創(chuàng)傷和關(guān)節(jié)不穩(wěn)定等病理條件下，軟骨細胞對過度的機械應(yīng)變作出反應(yīng)，表現(xiàn)為細胞凋亡和炎癥反應(yīng)，從而加速OA的進展。

機械敏感離子通道是細胞表面將機械力學刺激轉(zhuǎn)化為細胞內(nèi)電信號或化學信號的機械感受器。壓電型機械敏感離子通道組件1（Piezo1）在生長板軟骨細胞中發(fā)揮作用，并有助于發(fā)育過程中的軟骨形成和軟骨內(nèi)骨化。此外，Piezo1對異常的機械刺激作出反應(yīng)，導(dǎo)致軟骨細胞凋亡和衰老。然而，Piezo1在過度機械應(yīng)變誘導(dǎo)的OA中的潛在作用和機制尚不清楚。

鈣是真核細胞中bi;bu;ke;shao的第二信使，調(diào)控各種生理和生化過程，如合成代謝、表型維持和細胞凋亡。在OA軟骨中觀察到高鈣含量并引起軟骨基質(zhì)降解。鈣調(diào)磷酸酶（Calcineurin，CaN）-活化T細胞（NFAT）核因子信號軸的是鈣下游的關(guān)鍵信號。CaN是一種對鈣濃度敏感的磷酸酶，可使高度磷酸化的NFAT因子去磷酸化并導(dǎo)致其核易位。激活的NFAT1有助于基質(zhì)金屬酶和炎性細胞因子的表達，從而觸發(fā)OA。鑒于Piezo1響應(yīng)機械應(yīng)變傳遞鈣，因此推測機械應(yīng)變通過Piezo1 / CaN / NFAT1信號軸加重OA。

Gsmtx4是一種從狼蛛毒液中分離出來的肽，可以抑制Piezo1的活化。Gsmtx4在治療心肌梗死、遺傳性球形紅細胞增多癥和高血壓等多種疾病中的有益應(yīng)用已有大量證據(jù)。因此，通過Gsmtx4靶向Piezo1 / CaN / NFAT1信號軸對OA具有廣闊的治療潛力。

最近，在武漢大學人民醫(yī)院骨外科、中南醫(yī)院關(guān)節(jié)與運動醫(yī)學科的一項研究中，闡明了過度機械應(yīng)變加重OA的潛在機制，研究結(jié)果表明，Piezo1是軟骨細胞中響應(yīng)機械信號的基本分子，并通過CaN / NFAT1信號軸調(diào)節(jié)細胞凋亡和軟骨基質(zhì)代謝，并且Gsmtx4可能是針對OA治療的有吸引力的藥物。相關(guān)內(nèi)容發(fā)表在 International Journal of Molecular Sciences 題為“Gsmtx4 Alleviated Osteoarthritis through Piezo1/Calcineurin/NFAT1 Signaling Axis under Excessive Mechanical Strain"。

首先，為了確定Piezo1在OA軟骨中的表達，實驗收集了OA患者的關(guān)節(jié)軟骨組織，并在損傷或完整區(qū)域評估了Piezo1的表達，觀察到關(guān)節(jié)軟骨損傷區(qū)與完整區(qū)相比有明顯的軟骨退變（圖1 a）。免疫組織化學分析顯示，損傷區(qū)Piezo1蛋白水平較完整區(qū)升高（圖1 b）。類似的，發(fā)現(xiàn)Piezo1在手術(shù)誘導(dǎo)的OA大鼠關(guān)節(jié)軟骨中明顯上調(diào)（圖1 c、d）。

然后，從未成熟大鼠中分離軟骨細胞，以探索Piezo1在體外OA模型中的表達。過度的機械應(yīng)變是OA發(fā)展的關(guān)鍵致病機制。因此，在體外張力系統(tǒng)中培養(yǎng)軟骨細胞，以模擬OA進展中經(jīng)歷的過度機械應(yīng)變。結(jié)果顯示，暴露于循環(huán)機械應(yīng)變（1 Hz，20%）的軟骨細胞中，Piezo1的mRNA和蛋白水平以時間依賴性方式增加（圖1 e-g）。因此，可能是由于機械應(yīng)變， Piezo1 的水平在 OA 的關(guān)節(jié)軟骨中上調(diào)，特別是在損傷區(qū)域。

圖1   Piezo1在OA患者和大鼠的關(guān)節(jié)軟骨中上調(diào)

接下來，實驗確定了Piezo1在機械應(yīng)變信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用。明場圖像顯示，軟骨細胞的形態(tài)從多邊形變?yōu)榧忓N形，并且在暴露于12小時的機械應(yīng)變后出現(xiàn)凋亡小體。此外，機械應(yīng)變以時間依賴性方式導(dǎo)致軟骨細胞凋亡以及合成代謝和分解代謝失衡。鑒于機械應(yīng)變對軟骨細胞的影響在24 小時達到閾值，因此在后面的實驗中使用24 小時的機械應(yīng)變。

Piezo1是感知軟骨細胞表面機械信號的關(guān)鍵蛋白。因此，si-Piezo1 在軟骨細胞上施用以確定 Piezo1 在機械信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用。結(jié)果表明，si-Piezo1可以降低Piezo1的mRNA水平。實驗發(fā)現(xiàn)，si-Piezo1 逆轉(zhuǎn)了機械應(yīng)變引起的凋亡細胞比例的增加并改變了凋亡相關(guān)分子如BCL2相關(guān)X蛋白（BAX）和B細胞淋巴瘤/白血病-2 （BCL2）的表達。此外，si-Piezo1重新平衡了受機械應(yīng)變破壞的軟骨基質(zhì)合成代謝和分解代謝。

為了進一步確認Piezo1在機械信號傳導(dǎo)中的作用，用Yoda1處理軟骨細胞，Yoda1是一種有助于激活Piezo1的合成化合物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Yoda1處理的效果與機械應(yīng)變相似，呈現(xiàn)高比例的凋亡細胞，BAX，BCL2，MMP3，MMP13，COL2A1和聚集蛋白聚糖的表達改變。此外，si-Piezo1 可以減輕其對細胞凋亡或合成代謝/分解代謝失衡的影響。這些數(shù)據(jù)表明，機械應(yīng)變通過上調(diào)和激活Piezo1誘導(dǎo)軟骨細胞凋亡和合成代謝/分解代謝失衡。

Piezo1激活后，細胞質(zhì)中的鈣通過鈣內(nèi)流增加。因此，實驗專注于鈣信號傳導(dǎo)的主要下游途徑，CaN/NFAT信號傳導(dǎo)軸，以闡明Piezo1誘導(dǎo)軟骨細胞凋亡和合成代謝/分解代謝失衡的機制。結(jié)果表明，si-Piezo1抑制了機械應(yīng)變引起的鈣內(nèi)流和CaN的激活（圖2 a、b）。免疫熒光和蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明，si-Piezo1逆轉(zhuǎn)了機械應(yīng)變促進的NFAT1核易位（圖2 c、d）。接下來，在軟骨細胞上應(yīng)用Yoda1，以進一步探索Piezo1對CaN / NFAT1信號軸的影響。與機械應(yīng)變類似，Yoda1對鈣內(nèi)流、CaN活性和NFAT1的核易位有積極影響，并被si-Piezo1逆轉(zhuǎn)（圖2 e-g）。這些數(shù)據(jù)表明，機械應(yīng)變通過上調(diào)和激活Piezo1表達來激活CaN / NFAT1信號軸。

圖2   機械應(yīng)變下的Piezo1激活CaN/NFAT1信號軸。

然后，為了評估Piezo1/CaN/NFAT1信號軸在機械信號轉(zhuǎn)導(dǎo)上的必要性，使用Gsmtx4、CaN抑制劑CsA和NFAT抑制劑VIVIT peptide 特異性阻斷CaN/NFAT1信號傳導(dǎo)軸的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。結(jié)果表明，Gsmtx4降低了細胞內(nèi)鈣濃度，但幾乎不受CsA和VIVIT peptide的影響。同時，CsA和Gsmtx4都可以使機械應(yīng)變處理的軟骨細胞中CaN失活。免疫熒光和蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，Gsmtx4、CsA和VIVIT抑制NFAT1的核易位。最后，發(fā)現(xiàn)Gsmtx4，CsA和VIVIT可以保護軟骨細胞免受細胞凋亡以及合成代謝和分解代謝失衡。因此，Piezo1/CaN/NFAT1信號軸對于機械信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是必需的，阻斷Piezo1/CaN/NFAT1信號軸可以保護軟骨細胞免受機械應(yīng)變下的凋亡和合成代謝/分解代謝失衡。

最后，研究人員試圖研究通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射Gsmtx4阻斷Piezo1 / CaN / NFAT1信號軸對ACLT-誘導(dǎo)的OA大鼠的影響。實驗以兩種不同的頻率進行注射（H-Gsmtx4組每周一次，L-Gsmtx4組每兩周一次）（圖3 a）。結(jié)果顯示，術(shù)后8周ACLT組關(guān)節(jié)軟骨表面糜爛和蛋白聚糖丟失。與ACLT組相比，ACLT+L-Gsmtx4組和ACLT+H-Gsmtx4組關(guān)節(jié)軟骨破壞程度較輕，尤其是后者（圖3 b）。與ACLT組相比，Gsmtx4處理組的OARSI評分明顯較低，ACLT+H-Gsmtx4組低于ACLT+L-Gsmtx4組。此外，Gsmtx4降低了軟骨細胞的凋亡比例，且呈劑量依賴性（圖3 c）。免疫組織化學染色結(jié)果顯示，Gsmtx4注射降低了ACLT誘導(dǎo)OA模型中MMP3和MMP13的表達，增加了COL2A1和聚集蛋白聚糖的表達（圖3 d）。其中，高頻率關(guān)節(jié)內(nèi)注射Gsmtx4表現(xiàn)出較好的療效。這些數(shù)據(jù)表明，Gsmtx4可以通過抑制細胞凋亡和合成代謝/分解代謝失衡來改善大鼠的OA。

圖3   大鼠關(guān)節(jié)內(nèi)注射Gsmtx4可改善OA。

圖4   Gsmtx4在過度機械應(yīng)變下緩解OA的分子機制示意圖。

總之，該研究證明了Piezo1在機械應(yīng)變下上調(diào)和激活，并通過CaN / NFAT1信號軸引起軟骨細胞凋亡和合成代謝/分解代謝失衡。Piezo1抑制劑Gsmtx4在體內(nèi)和體外均可緩解OA。結(jié)果支持Piezo1 / CaN / NFAT1可能是OA的有希望的治療靶點。

參考文獻：Ren X, Zhuang H, Li B, Jiang F, Zhang Y, Zhou P. Gsmtx4 Alleviated Osteoarthritis through Piezo1/Calcineurin/NFAT1 Signaling Axis under Excessive Mechanical Strain. Int J Mol Sci. 2023 Feb 16;24(4):4022. doi: 10.3390/ijms24044022. PMID: 36835440; PMCID: PMC9961447.

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