乳腺癌是一種異質(zhì)性疾病，從局部上皮細胞的癌變轉(zhuǎn)移進展為遠端器官部位的繼發(fā)腫瘤。轉(zhuǎn)移級聯(lián)中的所有步驟都涉及腫瘤細胞與其遇到的不同動態(tài)微環(huán)境之間的機械相互作用，包括暴露于流體流動。腫瘤細胞會遇到兩種類型的流體流動：腫瘤微環(huán)境中的間質(zhì)液流動（interstitial flow）和血管或淋巴微環(huán)境中的流體流動（fluid flow）。盡管已知流體流動會顯著影響癌細胞的行為，但關(guān)于血管微環(huán)境中力的幅度如何影響癌癥進展期間的細胞事件的信息并不多。0.1-1 Pa幅度的機械力已被證明通過激活信號通路和誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子來影響細胞表型，其中一些因子有EMT（上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化）有關(guān)。

EMT是指上皮細胞失去上皮表型，獲得間質(zhì)細胞表型的過程，期間細胞的粘附和力學特性發(fā)生顯著改變，促進腫瘤細胞與原發(fā)腫瘤的分離。TGF-β通路以其參與癌細胞中的EMT而聞名。了解流體流動等機械力如何促進EMT和轉(zhuǎn)移事件，將有助于識別可用于促進乳腺癌早期診斷和分類的關(guān)鍵基因，從而更好地確定患者的治療方案。

一旦腫瘤細胞在血流的生物物理學力作用下存活下來，它必須粘附在繼發(fā)性腫瘤形成部位的血管內(nèi)皮細胞上，外滲，并在開始生長之前存活。癌細胞粘附需要在癌細胞和內(nèi)皮細胞上表達同源配體和受體，特別是整合素、膠原蛋白、選擇素和活化的白細胞細胞粘附分子（ALCAM）。其中一些粘附分子已被證明在癌癥進展中起著關(guān)鍵作用，然而，沒有研究調(diào)查乳腺癌細胞先前暴露于血流產(chǎn)生的剪切應(yīng)力如何影響參與促進隨后粘附到內(nèi)皮細胞的基因的表達。

在加拿大卡爾加里大學細胞和分子生物工程研究實驗室團隊的一項研究中，利用平行板流動室組成的生物反應(yīng)器系統(tǒng)將乳腺癌細胞暴露于中等水平的流體流動中，基因表達分析用于評估血流誘導(dǎo)的乳腺癌細胞的變化，網(wǎng)絡(luò)分析用于確定參與促進EMT和細胞粘附的基因之間的關(guān)鍵相互作用。研究人員假設(shè)以流體流動產(chǎn)生的剪切應(yīng)力刺激乳腺癌細胞會增加乳腺癌細胞對內(nèi)皮細胞的粘附，此外，還評估了流動刺激和未刺激的乳腺癌細胞在體外粘附內(nèi)皮細胞單層的能力。相關(guān)成果發(fā)表在 Breast Cancer Research 期刊題為“Fluid flow exposure promotes epithelial-to-mesenchymal transition and adhesion of breast cancer cells to endothelial cells"。

流體流動影響乳腺癌細胞系基因表達并富集參與轉(zhuǎn)移的細胞過程

為了研究流體流動對乳腺癌細胞系基因表達的影響，將BT-474、MCF-7、MDA-MB-231和SK-BR-3乳腺癌細胞暴露于1 Pa大小的剪切流中。分析全基因組表達數(shù)據(jù)時，觀察到流動暴露和非暴露細胞之間的基因表達譜存在顯著差異（圖1 a）。剪切力暴露時，每個乳腺癌細胞系中至少有150個基因差異表達（圖1 b）。MDA-MB-231基底細胞系在流動刺激下具有差異表達最多的基因（圖1 b）?；准毎橄侔┦侨橄侔﹝ui;ju侵襲性的亞型之一，具有du;te的生物學特征，其特征是早期轉(zhuǎn)移模式。

為了確定受流動暴露顯著影響的關(guān)鍵分子功能和生物過程，進行了基因集富集分析。參與導(dǎo)致癌轉(zhuǎn)移進展的細胞過程的基因亞群在流動刺激下在大多數(shù)細胞系中深度富集。在所有暴露于流動的乳腺癌細胞中，觀察到參與調(diào)節(jié)EMT（圖1 c），正調(diào)節(jié)細胞運動（圖1 d），調(diào)節(jié)細胞-基質(zhì)粘附（圖1 e），以及正調(diào)節(jié)細胞間粘附（圖1 f）的基因顯著富集。此外，觀察到幾種膠原蛋白，整合素和其他細胞粘附分子（包括FN1和ALCAM）的上調(diào)，表明在流動暴露時癌細胞粘附性能的調(diào)節(jié)。

圖1   （a）靜態(tài)和流動暴露的MDA-MB-231，BT-474，SK-BR-3和MCF-7乳腺癌細胞之間差異表達基因的熱圖。（b）靜態(tài)和流動暴露乳腺癌細胞之間差異表達基因的數(shù)量。乳腺癌細胞暴露于流體中，參與轉(zhuǎn)移進展的分子過程豐富，包括上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)（c）、細胞運動的正調(diào)節(jié)（d）、細胞-細胞粘附的正調(diào)節(jié)（e）和細胞-基質(zhì)粘附的調(diào)節(jié)（f）。

流體流動上調(diào)乳腺癌細胞中EMT基因和蛋白質(zhì)的表達

為了進一步研究血流刺激時的EMT調(diào)節(jié)，分析了由人EMT的PCR陣列創(chuàng)建的EMT基因集中的基因表達。數(shù)據(jù)分析揭示了每個乳腺癌細胞系在流動刺激后差異表達的EMT基因的熱圖，包括EMT誘導(dǎo)因子如FN1、SNAI2、SERPINE1、NOTCH1、TCF4、MMP2、PLAU、WNT5A和WNT5B的一致上調(diào)。EMT抑制因子，如KRT19和TSPAN13在幾種細胞系中下調(diào)。此外，觀察到在MDA-MB-231細胞中，在0.2 Pa和0.6 Pa的較低剪切應(yīng)力刺激和停止刺激后，流動誘導(dǎo)的SNAI2上調(diào)持續(xù)了24小時。

此外，還比較了MDA-MB-231細胞的靜態(tài)和流動來源的EMT蛋白表達譜。在流動刺激的MDA-MB-231細胞中，通過同時上調(diào)Snail和Vimentin來促進EMT。這些發(fā)現(xiàn)與VIM和SNAI2的qPCR表達數(shù)據(jù)一致，VIM和SNAI2分別編碼Vimentin和Snail。E-鈣黏蛋白在MDA-MB-231細胞中以低水平表達。此外，還觀察到在MCF-7和BT-474細胞的流動暴露中CDH1輕微或沒有下調(diào)，CDH2上調(diào)，表明向更多的間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)變。

接下來，比較了在化學誘導(dǎo)EMT、流體流動刺激或在靜態(tài)條件下培養(yǎng)的HMECs（人乳腺上皮細胞）中E-鈣黏蛋白、Vimentin和Snail的表達水平。與靜態(tài)對照相比，Snail 和Vimentin在流動暴露和EMT誘導(dǎo)的細胞中均上調(diào)，而E-鈣黏蛋白在三種條件下的表達沒有顯著差異，流動刺激的HMECs中SNAI2和VIM上調(diào)，CDH1變化不顯著。這些結(jié)果表明，將HMECs暴露于流體流動會刺激向EMT表型的進展，類似于化學誘導(dǎo)。

Smad3 而非 smad2 敲低影響流動誘導(dǎo)的 SNAI2 上調(diào)

Smad2/3是癌癥中EMT的已知調(diào)節(jié)劑，也已知具有血流反應(yīng)性。在MDA-MB-231細胞中測量Smad2水平，發(fā)現(xiàn)在流動暴露后降低（圖2）。為了研究Smad2或Smad3參與血流誘導(dǎo)的SNAI2上調(diào)，用Smad2或Smad3 siRNA轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細胞。SNAI2在對照和轉(zhuǎn)染Smad2 siRNA的細胞中分別上調(diào)2.2和2.8倍。當用Smad3 siRNA轉(zhuǎn)染細胞時，差異表達不顯著（1.4倍）。用Smad2和Smad3轉(zhuǎn)染分別導(dǎo)致 91% 和 86% 的敲低。

圖2   （a）在MDA-MB-231細胞中通過蛋白質(zhì)印跡測定的Smad2蛋白表達（總SMAD2和pSmad2-連接物）。（b）對照（-），Smad2或Smad3 siRNA轉(zhuǎn)染并用流體流動刺激20小時的MDA-MB-231細胞中SNAI2表達的定量RT-PCR分析。

網(wǎng)絡(luò)分析揭示了參與細胞流動反應(yīng)的關(guān)鍵基因

為了可視化可能參與促進流動刺激乳腺癌細胞中EMT和細胞粘附的分子相互作用網(wǎng)絡(luò)，使用Cytoscape軟件平臺導(dǎo)入并分析了流動暴露和靜態(tài)對照的基因表達數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)表明，當乳腺癌細胞暴露于流動刺激時，蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)高度模塊化。由于FN1在大多數(shù)流動暴露細胞中的過表達及其在EMT和細胞粘附中的作用，因此分析了其相互作用子網(wǎng)絡(luò)，以更好地了解流動刺激如何影響乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移事件。MDA-MB-231和 MCF-7 的FN1子網(wǎng)絡(luò)揭示了FN1過表達可能促進乳腺癌細胞EMT和粘附的功能聯(lián)系。

生物反應(yīng)器衍生的表達變化概括了臨床乳腺癌基因表達譜

為了研究實驗的發(fā)現(xiàn)與人類乳腺癌進展的相關(guān)性，使用癌癥基因組圖譜（TCGA）的數(shù)據(jù)分析了FN1及其PLAU和ALCAM的基因表達數(shù)據(jù)。與健康志愿者相比，F(xiàn)N1，PLAU和ALCAM在大多數(shù)乳腺癌亞型患者中上調(diào)，大多數(shù)乳腺癌階段患者的FN1，PLAU和ALCAM也上調(diào)。

接下來，在2878例患者的乳腺腫瘤微陣列數(shù)據(jù)集中評估FN1、PLAU和ALCAM的預(yù)后價值。與FN1和PLAU表達低的患者相比，F(xiàn)N1和PLAU表達高的患者的生存率降低。ALCAM表達的生存圖顯示出類似的模式。

流體流動刺激增加乳腺癌細胞的粘附、遷移和侵襲能力

最后，評估了流動刺激和未刺激的MDA-MB-231和MCF-7細胞粘附在內(nèi)皮單層上的能力。圖3 a顯示了在未刺激和流動刺激的MDA-MB-231細胞流過內(nèi)皮單層后獲得的癌細胞-內(nèi)皮細胞粘附圖像。在超過4分鐘的所有時間點，流動刺激的MDA-MB-4細胞比未刺激的細胞更多的粘附在內(nèi)皮細胞上（圖3 a、b）。此外，與未刺激的細胞相比，流動刺激的MDA-MB-231和MCF-7細胞在靜態(tài)粘附實驗中表現(xiàn)出對內(nèi)皮單層的更強粘附（圖3 c）。此外，還觀察到MDA-MB-231（圖3 d）和 MCF-7（圖3 e）細胞在流動刺激后，一組關(guān)鍵的癌細胞粘附基因顯著上調(diào)。Transwell遷移和侵襲測定用于研究流動刺激和未刺激細胞的遷移和侵襲能力。圖3 f表明MDA-MB-231細胞暴露于流體流動會增加它們通過Transwell膜遷移和侵襲的能力。總之，這些結(jié)果揭示了暴露于流體流動在增強乳腺癌細胞在轉(zhuǎn)移部位的遷移、粘附到內(nèi)皮細胞和通過膜侵襲方面的潛在作用。

圖3   （a）未刺激和血流刺激的MDA-MB-231細胞在幾個時間點粘附在內(nèi)皮單層的代表性相襯圖像。流動（b）和靜態(tài)（c）粘附研究中流動刺激（黑線）和未刺激（灰線）細胞的相對粘附。靜態(tài)和流動暴露的MDA-MB-231（d）和MCF-7（e）乳腺癌細胞之間差異表達的細胞粘附基因的熱圖。（f）transwell 測定中流動刺激和未刺激的MDA-MB-231乳腺癌細胞的遷移和侵襲比較。

總之，該研究使用平行平板流室系統(tǒng)，創(chuàng)建了一個乳腺癌進展的實驗?zāi)Ｐ?，并鑒定了在患者群體中差異表達的生物標志物，表明1 Pa左右的流體剪切力可促進EMT和乳腺癌細胞與內(nèi)皮單層的粘附，并且已鑒定的生物標志物在患者群體中明顯表達。研究了解剪切應(yīng)力等生物物理力如何影響乳腺癌轉(zhuǎn)移進展所涉及的細胞過程對于識別疾病進展的新分子標志物和預(yù)測轉(zhuǎn)移風險非常重要。這些發(fā)現(xiàn)支持使用基于流動的模型來進一步研究流體環(huán)境如何影響癌細胞及其轉(zhuǎn)移能力。該研究結(jié)果表明，體外模型允許識別生物標志物，這些生物標志物可用于識別已經(jīng)經(jīng)歷EMT的細胞以及可能正在循環(huán)的腫瘤細胞。使用該系統(tǒng)研究涉及乳腺癌發(fā)展和進展的細胞事件可能會為轉(zhuǎn)移性乳腺癌提供新的診斷和治療方法。

參考文獻：Fuh KF, Shepherd RD, Withell JS, Kooistra BK, Rinker KD. Fluid flow exposure promotes epithelial-to-mesenchymal transition and adhesion of breast cancer cells to endothelial cells. Breast Cancer Res. 2021 Oct 12;23(1):97. doi: 10.1186/s13058-021-01473-0. PMID: 34641959; PMCID: PMC8507133.

微信搜索公眾號“Naturethink"，了解更多細胞體外仿生培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用。