胰島細(xì)胞移植已成為一種潛在的細(xì)胞療法，可為遇到嚴(yán)重低血糖發(fā)作的特定 1 型糖尿病患者恢復(fù)葡萄糖穩(wěn)態(tài)。細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致移植的胰島細(xì)胞死亡的最重要因素。胰島破壞的早期引發(fā)因素是缺氧，損害β細(xì)胞功能和存活。缺氧還通過活性氧（ROS）的過量產(chǎn)生誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致移植前后細(xì)胞凋亡。因此，有必要通過臨床上可行的方法來抑制細(xì)胞凋亡并提高胰島質(zhì)量，以獲得更好的移植結(jié)果。

一些研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）在培養(yǎng)期間和移植后通過分泌旁分泌因子或直接接觸細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生對胰島的存活和功能具有支持作用。氧濃度是影響間充質(zhì)干細(xì)胞的重要因素。研究表明，缺氧預(yù)處理的MSC（Hpc-MSCs）在1-7% O2在短時間內(nèi)激活A(yù)kt和細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號通路，顯著增強抗凋亡，抗氧化，促生存和促血管生成因子的產(chǎn)生，例如Bcl-2、VEGF、HGF、過氧化氫酶和Ho-1。移植的HPC-MSCs在肺纖維化、心肌損傷、急性腎臟、腦和肝臟損傷等多種疾病中顯示出有效的治療效果。然而，關(guān)于Hpc-MSCs與胰島細(xì)胞共培養(yǎng)或共移植的研究非常有限，需要更多的研究。

基于此，伊朗德黑蘭醫(yī)科大學(xué)、設(shè)拉子醫(yī)科大學(xué)科研團隊的一項研究曾探討了HPC-MSCs在直接和間接共培養(yǎng)體系中是否能降低應(yīng)激因子，抑制線粒體凋亡通路，改善人胰島生存和功能，該研究使用了Wharton's Jelly 來源的MSC（WJ-MSCs），因為與其他來源的MSCs相比，它不表達主要的組織相容性復(fù)合體II類（MHC-II），更容易獲得，并且增殖能力更高。

HPC-MSCs和Nc-MSCs中VEGF分泌的比較

為了證實缺氧對WJ-MSCs的積極作用，實驗首先評估了在缺氧（HPC-MSCs，5% O2，5% CO2）和正常條件（Nc-MSCs，20% O2，5% CO2）下培養(yǎng)24小時后的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）分泌（缺氧增強的生長因子之一）。結(jié)果顯示，HPC-MSCs中的VEGF含量幾乎是Nc-MSCs的3倍。

WJ-MSCs 在培養(yǎng)期間增加了人類胰島的存活率

生存評估顯示，在培養(yǎng)期間，對照組中胰島細(xì)胞存活率約為25%，與MSCs共培養(yǎng)將胰島細(xì)胞存活率提高到100%。HPC-MSCs和Nc-MSCs共培養(yǎng)組的存活率相似，兩者之間無顯著差異（圖1）。

圖1   與Hpc-MSCs和Nc-MSCs共培養(yǎng)的人胰島存活率。

WJ-MSCs在培養(yǎng)期間抑制人胰島細(xì)胞凋亡

對照組中凋亡胰島細(xì)胞的百分比約為70%，而與WJ-MSCs共培養(yǎng)將胰島細(xì)胞死亡率降低至10% 以下。兩個直接共培養(yǎng)組的減少量比間接共培養(yǎng)組更顯著，但Hpc-MSCs組和Nc-MSCs組之間沒有差異（圖2）。

圖2   與HPC-MSCs和Nc-MSCs共培養(yǎng)的人胰島細(xì)胞的凋亡。

共培養(yǎng)胰島細(xì)胞中Bcl-2增加，Bax和Caspase-3 減少

在共培養(yǎng)胰島細(xì)胞中，抗凋亡標(biāo)志物Bcl-2顯著增加，促凋亡標(biāo)志物 Bax在基因表達和蛋白質(zhì)水平上顯著降低。HPC-MSCs組和Nc-MSCs組之間沒有明顯差異。caspase-3 蛋白作為細(xì)胞凋亡的主要指標(biāo)，在共培養(yǎng)胰島細(xì)胞中得到顯著降低。caspase-3 的基因表達在所有共培養(yǎng)組中也降低，但是在任何組中都不顯著。

直接共培養(yǎng)的 HPC-MSCs 組顯著提高了胰島功能

所有共培養(yǎng)胰島細(xì)胞的胰島素和C肽分泌均增加。直接共培養(yǎng)組的增量大于間接共培養(yǎng)組。然而，僅在直接共培養(yǎng)的HPC-MSCs組中觀察到顯著增加（圖3 a、b）。所有共培養(yǎng)組的胰島素mRNA水平均增強。在直接共培養(yǎng)的 Hpc 和 Nc-MSCs 組中均觀察到統(tǒng)計學(xué)意義（圖3 c）。

圖3   葡萄糖刺激（a）C肽和（b）胰島素分泌物以及（c）胰島素mRNA表達在與Hpc-MSCs和Nc-MSCs共培養(yǎng)的人胰島細(xì)胞中的表達。

HIF-1α在胰島中檢測到，在共培養(yǎng)組中降低

HIF-1α蛋白作為缺氧的主要標(biāo)志物，在缺氧條件下均有表達，但在共培養(yǎng)的胰島中存在WJ-MSCs時降低。與對照組相比，胰島細(xì)胞共培養(yǎng)組HIF-1α mRNA表達降低，但下降不顯著。這可能與缺氧條件下HIF-1α在蛋白質(zhì)穩(wěn)定性水平上的調(diào)控有關(guān)。

WJ-MSCs 存在下抑制 p53 蛋白

p53蛋白被檢測為HIF-1α在長時間缺氧條件下穩(wěn)定的下游靶點之一。結(jié)果顯示，p53僅存在于對照組中，并且在所有共培養(yǎng)胰島細(xì)胞中均受到抑制，提示W(wǎng)J-MSCs對胰島細(xì)胞凋亡具有抗凋亡作用（圖4）。

圖4   與 Hpc-MSCs 和 Nc-MSCs 共培養(yǎng)的人胰島中的 p53 蛋白水平。

WJ-MSCs 存在下 ROS 顯著降低

實驗還在離體胰島中測量與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)的氧化標(biāo)記物ROS的產(chǎn)生。在培養(yǎng)后，還檢測了Nc-MSCs和Hpc-MSCs中單獨的ROS量，以恢復(fù)共培養(yǎng)組的標(biāo)準(zhǔn)化。將胰島對照組和共培養(yǎng)組進行比較（圖5）。ROS產(chǎn)量在胰島對照組中最高，而在與HPC-MSCs和Nc-MSCs間接共培養(yǎng)的胰島中較低。在接觸MSC的情況下，ROS的產(chǎn)量是所有胰島組中zui高的。這可能表明間充質(zhì)干細(xì)胞對分離的胰島細(xì)胞具有抗氧化作用。培養(yǎng)5 天后，Nc-MSCs（對照）中的ROS量低于Hpc-MSCs（對照）組，但差異不顯著。

圖5   與 Hpc-MSCs 和 Nc-MSCs 共培養(yǎng)的人類胰島細(xì)胞中的 ROS 產(chǎn)生。

與 Hpc-WJ-MSCs 共培養(yǎng)胰島細(xì)胞中的 VEGF 顯著增強

VEGF mRNA在胰島對照組中zui低，而在與Hpc-MSCs和Nc-MSCs直接接觸和間接接觸共培養(yǎng)的胰島細(xì)胞中誘導(dǎo)的VEGF mRNA轉(zhuǎn)錄水平相對較高。然而，這僅在直接和間接 HPC-MSCs 共培養(yǎng)組中顯著觀察到（圖6 a）。

在胰島對照組和胰島共培養(yǎng)組中也評估了VEGF分泌。將胰島對照組和共培養(yǎng)組進行比較（圖6 b）。VEGF分泌在HPc-MSCs共培養(yǎng)組（直接和間接）中最高，在Nc-MSCs共培養(yǎng)組中中等，在胰島對照組中zui低。有趣的是，在培養(yǎng)5天后，單獨Hpc-MSCs中的VEGF含量仍然高于Nc-MSCs。

圖6   與Hpc-MSCs和Nc-MSCs共培養(yǎng)的人胰島中的VEGF分泌和mRNA表達。

鑒于胰島在1型糖尿病治療中的應(yīng)用前景廣闊，因此有必要關(guān)注與胰島的最佳分離，培養(yǎng)期和移植相關(guān)的所有方面。綜上所述，該研究表明，Hpc-WJ-MSCs作為移植前培養(yǎng)的支持細(xì)胞，可以保護離體的人胰島細(xì)胞免受應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，為移植成功提供可存活胰島和提升胰島功能，特別是通過直接共培養(yǎng)系統(tǒng)。

參考文獻：Keshtkar S, Kaviani M, Jabbarpour Z, Sabet Sarvestani F, Ghahremani MH, Esfandiari E, Hossein Aghdaei M, Nikeghbalian S, Shamsaeefar A, Geramizadeh B, Azarpira N. Hypoxia-Preconditioned Wharton's Jelly-Derived Mesenchymal Stem Cells Mitigate Stress-Induced Apoptosis and Ameliorate Human Islet Survival and Function in Direct Contact Coculture System. Stem Cells Int. 2020 Dec 17;2020:8857457. doi: 10.1155/2020/8857457. PMID: 33381188; PMCID: PMC7759420.