腹主動(dòng)脈瘤（AAA）的發(fā)病率近年來一直在上升。AAA是主動(dòng)脈的病理性擴(kuò)張，有潛在的破裂風(fēng)險(xiǎn)，可能受到遺傳、環(huán)境、飲食、吸煙狀況、生物力學(xué)和血流動(dòng)力學(xué)等多種因素的影響。

血管壁不斷受到各種剪切應(yīng)力，內(nèi)皮細(xì)胞充當(dāng)將血液與血管壁分開的屏障。因此，血管內(nèi)皮細(xì)胞可能與健康或易患病表型的發(fā)育有關(guān)。先前的證據(jù)表明，血管壁可能受到局部血流動(dòng)力學(xué)因素（如機(jī)械應(yīng)力變化）的損害，這也是發(fā)生AAA的原因之一。然而，機(jī)械應(yīng)力在AAA發(fā)病機(jī)制中的具體分子調(diào)控機(jī)制仍有待探索。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）反應(yīng)是未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)積聚的結(jié)果，也稱為未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）。ER應(yīng)激在干擾正常細(xì)胞生理功能方面起作用，其中AAA的發(fā)病機(jī)制已被證明。已有研究報(bào)道，ERS介導(dǎo)的JNK/AP-1（c-Jun 氨基末端蛋白激酶/激活蛋白-1）通路可促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)，如Toll樣受體-4（TLR-4）、白細(xì)胞介素-1 β（IL-1β）、IL-6和MCP-1。此外，JNK抑制劑損害了動(dòng)物模型中的AAA消退。

MiR-137 是一種位于染色體 1p21.3 上的非蛋白編碼 RNA，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)。在最近的一項(xiàng)研究中，發(fā)現(xiàn)miR-137在H2O2-處理的心肌細(xì)胞中顯著上調(diào)，通過靶向CDC42參與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞ERS，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡。

基于此，云南省第二人民醫(yī)院血管外科、第三人民醫(yī)院藥劑科研究團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)曾探討了miR-137在剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HAECs）中的表達(dá)及其在HAECs的ER應(yīng)激和細(xì)胞凋亡中的潛在調(diào)控機(jī)制。研究結(jié)果為AAA的發(fā)病機(jī)制提供了進(jìn)一步的思路，為AAA的診斷和臨床治療提供了可能的分子靶點(diǎn)和理論依據(jù)。

剪切應(yīng)力對(duì)HAECs表面和內(nèi)部形態(tài)的影響

不同強(qiáng)度的剪切應(yīng)力響應(yīng)細(xì)胞形態(tài)的變化如圖1 A所示。在低強(qiáng)度剪切應(yīng)力（0-5 dyn/cm2）下，細(xì)胞形狀逐漸由紡錘形變?yōu)閳A形，細(xì)胞增殖減慢。隨著時(shí)間的流逝，細(xì)胞形狀逐漸變得不完整，并出現(xiàn)明顯的收縮。值得注意的是，在暴露于5 dyn/cm2下時(shí)觀察到細(xì)胞碎片增加。然而，當(dāng)HAECs暴露于10或15 dyn/cm2時(shí)，細(xì)胞凋亡逐漸減弱。

觀察細(xì)胞的內(nèi)部形態(tài)如圖1 B所示。當(dāng)沒有剪切應(yīng)力時(shí)，核周區(qū)、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)均具有正常的形態(tài)結(jié)構(gòu)。暴露于逐漸增加的剪切應(yīng)力后，細(xì)胞中逐漸出現(xiàn)核周空間和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹以及剝落的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。當(dāng)剪切應(yīng)力超過 5 dyn/cm2 時(shí)，這種趨勢(shì)逐漸減弱。

圖1   剪切應(yīng)力對(duì)HAECs表面和內(nèi)部形態(tài)的影響。

低強(qiáng)度剪切應(yīng)力促進(jìn) HAECs 中的氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡

接下來，實(shí)驗(yàn)測(cè)量了不同水平的剪切應(yīng)力對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的影響。如圖2 a所示，當(dāng)細(xì)胞暴露于1 dyn/cm2、2 dyn/cm2和5 dyn/cm2剪切應(yīng)力時(shí)，NOX2、P22phox、NOX4、NRF2 的蛋白質(zhì)水平顯著增加。此外，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量隨著剪切應(yīng)力的增加而增加，在5 dyn/cm2的細(xì)胞中觀察到陽(yáng)性細(xì)胞的峰值（圖2 b）。實(shí)驗(yàn)還檢測(cè)了與細(xì)胞凋亡相關(guān)的分子的蛋白質(zhì)水平，結(jié)果顯示Bax、Bak和Caspase-3的蛋白質(zhì)水平依賴于剪切應(yīng)力強(qiáng)度的增加。此外，在暴露于1 dyn/cm2、2 dyn/cm2和5 dyn/cm2剪切應(yīng)力時(shí)，細(xì)胞中Bcl-1蛋白的表達(dá)水平的剪切應(yīng)力強(qiáng)度依賴性降低（圖2 c）。

圖2   低強(qiáng)度剪切應(yīng)力促進(jìn) HAECs 中的氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。

低強(qiáng)度剪切應(yīng)力上調(diào) miR-137 表達(dá)，miR-137 直接靶向 HAECs 中的 SDS22

為了證實(shí)miR-137可能參與低強(qiáng)度剪切應(yīng)力引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)和HAECs中的細(xì)胞凋亡，實(shí)驗(yàn)評(píng)估了miR-137在暴露于0-5 dyn/cm2剪切應(yīng)力的HAECs中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-137隨著剪切應(yīng)力的增加而逐漸上調(diào)（圖3 a）?；谏镄畔W(xué)軟件TargetScan，研究將SDS22確定為miR-137的候選靶基因（圖3 b）。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定，結(jié)果表明，與共轉(zhuǎn)染 SDS22-MUT 的細(xì)胞相比，共轉(zhuǎn)染 SDS22-WT 時(shí)miR-137 模擬物顯著降低了HAECs中的熒光素酶活性，而miR-137抑制劑具有相反的結(jié)果（圖3 c）。這些發(fā)現(xiàn)支持SDS22是miR-137的直接靶點(diǎn)。此外，隨著剪切應(yīng)力的逐漸增加，HAECs 中 SDS22 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平也逐漸降低（圖3 d、e）。

圖3   低強(qiáng)度剪切應(yīng)力上調(diào)miR-137表達(dá)，直接靶向HAECs中SDS22的3′-非翻譯區(qū)（3′-UTR）。

miR-137的沉默逆轉(zhuǎn)了剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的JNK/AP-1信號(hào)的激活

接下來探索了與miR-137在調(diào)控剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的HAECs細(xì)胞凋亡中相關(guān)的潛在分子通路。研究發(fā)現(xiàn)，抑制SDS22表達(dá)可增加p-JNK水平。根據(jù)這些觀察結(jié)果，研究人員懷疑miR-137可以通過靶向SDS22激活JNK/AP-1信號(hào)通路。

使用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)JNK/AP-1信號(hào)通路中涉及的基因的表達(dá)水平，包括p-JNK、JNK、p-c-Jun、c-Jun、p-c-Fos和c-Fos。如圖4 a所示，p-JNK、p-c-Jun和p-c-Fos的蛋白質(zhì)水平以剪切應(yīng)力強(qiáng)度依賴性方式增加，表明暴露于剪切應(yīng)力的HAECs中JNK / AP-1信號(hào)的激活。

接下來，敲低了 HAECs 中的 miR-137 表達(dá)，并研究了 miR-137 沉默對(duì)剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的 JNK/AP-1 信號(hào)激活的影響。圖4 b顯示miR-137敲低后miR-137表達(dá)水平顯著降低，證實(shí)了miR-137的成功敲低。蛋白質(zhì)印跡分析顯示，與剪切應(yīng)力組相比，當(dāng)miR-137被敲低時(shí)，p-JNK、p-c-Jun和p-c-Fos的相對(duì)蛋白表達(dá)受到顯著抑制（圖4 c）。這些觀察結(jié)果表明，miR-137可能是控制低強(qiáng)度剪切應(yīng)力下JNK/AP-1信號(hào)激活的重要調(diào)節(jié)因子。

圖4   miR-137的沉默逆轉(zhuǎn)了剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的JNK/AP-1信號(hào)通路的激活。

miR-137的沉默減弱了剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡

最后，研究了miR-137敲低對(duì)剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的影響。在TEM觀察下，在暴露于剪切應(yīng)力的細(xì)胞中觀察到嚴(yán)重腫脹的核周區(qū)域、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，然而，與對(duì)照細(xì)胞相比，當(dāng)miR-137沉默時(shí)，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)僅發(fā)現(xiàn)輕微腫脹變化（圖5 A）。TUNEL染色結(jié)果顯示，與剪切應(yīng)力組相比，轉(zhuǎn)染miR-137抑制劑的細(xì)胞凋亡也顯著改善（圖5 A）。與對(duì)照相比，剪切應(yīng)力顯著上調(diào)了氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)水平，包括NOX2、p22phox、NOX4和NRF2。此外，miR-137抑制劑在不同程度上降低了這些基因的上調(diào)水平（圖5 B）。與對(duì)照組相比，剪切應(yīng)力顯著降低了Bcl-2的表達(dá)水平，上調(diào)了Bak、Bax和半胱天冬酶-3的表達(dá)水平。值得注意的是，miR-137抑制劑在一定程度上逆轉(zhuǎn)了剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的Bcl-2、Bak、Bax和Caspase-3的調(diào)控異常（圖5 C）。這些發(fā)現(xiàn)表明，miR-137敲低可以有效地逆轉(zhuǎn)剪切應(yīng)力引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。

圖5   miR-137的沉默減弱了剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。

圖6   圖形概要

MiR-137通過JNK/AP-1信號(hào)通路調(diào)控低強(qiáng)度剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。

綜上所述，該研究證明了miR-137在剪切應(yīng)力刺激的HAECs中的潛在調(diào)節(jié)作用，可以通過靶向SDS22調(diào)控JNK/AP-1信號(hào)通路來促進(jìn)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。研究提供了證據(jù)支持miR-137在介導(dǎo)剪切應(yīng)力急性反應(yīng)中的關(guān)鍵作用，這可能為AAA的分子診斷和靶向治療提供新的生物標(biāo)志物。

參考文獻(xiàn)：Li GJ, Yang QH, Yang GK, Wan J, Du LJ, Li ZX, Sun Y. MiR-137 regulates low-intensity shear stress-induced human aortic endothelial cell apoptosis via JNK/AP-1 signaling. J Physiol Biochem. 2021 Aug;77(3):451-460. doi: 10.1007/s13105-021-00812-1. Epub 2021 Apr 24. PMID: 33893994.

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