間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）已被應(yīng)用于治療各種不治之癥，并且大量研究已經(jīng)探索了與其治療特性相關(guān)的旁分泌和抗炎作用。已知間充質(zhì)干細(xì)胞會(huì)遷移到受損組織或炎癥部位，在那里它們受到干擾素（IFN）-γ、TNF-α或白細(xì)胞介素（IL）-1β等炎性細(xì)胞因子的刺激，以表達(dá)各種免疫抑制因子，包括吲哚胺2，3-雙加氧酶（IDO）、前列腺素E2（PGE2）、腫瘤壞死因子（TNF）-α刺激基因-6（TSG-6）、一氧化氮（NO）、IL-6、IL-10等。巨噬細(xì)胞在炎癥部位分泌包括TNF-α和IL-1β在內(nèi)的各種炎性細(xì)胞因子，它們可以通過間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)TSG-6的表達(dá)。

TSG-6是一種與炎癥相關(guān)的多功能蛋白，具有抗炎和組織保護(hù)特性。此外，TSG-6在炎性細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖和發(fā)育過程中起重要作用。TSG-6可通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞泡沫細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的遷移和增殖來抑制炎癥反應(yīng)。TSG-6可通過抑制TGF-β信號(hào)通路來調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而達(dá)到抗纖維化的效果。

暴露于炎癥環(huán)境的MSCs可以通過表達(dá)TSG-6來調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞的活性來再生受損組織。盡管包括TNF-α和IL-1β在內(nèi)的炎性細(xì)胞因子可以增加TSG-6表達(dá)，但對(duì)MSCs和巨噬細(xì)胞之間TSG-6表達(dá)的關(guān)系知之甚少。

基于此，韓國(guó)延世大學(xué)原州醫(yī)學(xué)院外科、內(nèi)科以及醫(yī)學(xué)研究中心的研究團(tuán)隊(duì)假設(shè)在不同過渡狀態(tài)的巨噬細(xì)胞相關(guān)的間充質(zhì)干細(xì)胞中，TSG-6的表達(dá)可能存在差異。因此，在一項(xiàng)研究中，研究人員希望確定巨噬細(xì)胞的哪些轉(zhuǎn)移狀態(tài)可能參與脂肪干細(xì)胞（ASCs）中的TSG-6表達(dá)，哪些類型的細(xì)胞因子對(duì)TSG-6表達(dá)很重要，以及哪些信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)TSG-6表達(dá)。為了探索這些問題，研究了TSG-6在ASCs和M0、M1和M2巨噬細(xì)胞間接共培養(yǎng)后的表達(dá)以及ASCs中TSG-6表達(dá)的最佳條件。此外，針對(duì)TSG-6的抗纖維化作用，研究了表達(dá)TSG-6的ASCs和巨噬細(xì)胞是否能夠緩解TGF-β誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞纖維化。

與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后 ASCs 中 TSG-6 mRNA 的表達(dá)增加

由于MSCs在炎癥環(huán)境中誘導(dǎo)TSG-6表達(dá)，因此研究了MSCs中的TSG-6表達(dá)是否因巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)換狀態(tài)而不同。ASCs單獨(dú)培養(yǎng)或與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，并分別用IFN-γ和LPS或IL-4和IL-13處理，它們分別促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1或M2表型的轉(zhuǎn)變，然后分析TSG-6表達(dá)。結(jié)果表明，無(wú)論巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化狀態(tài)如何，都會(huì)增加ASCs中的TSG-6表達(dá)。M0 和 M2 巨噬細(xì)胞分別使 TSG-6 表達(dá)增加了 5 倍和 15 倍，而 M1 巨噬細(xì)胞顯著增加了 ASCs 中的 TSG-6 表達(dá)約 62 倍（圖1）。這些結(jié)果表明，與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)增加了ASCs中TSG-6的表達(dá)，并且M1巨噬細(xì)胞或促炎性條件可能在ASCs的TSG-6表達(dá)中起特別重要的作用。

接下來，分析了巨噬細(xì)胞是否對(duì)ASCs中的TSG-6表達(dá)至關(guān)重要，以及TSG-6是否在巨噬細(xì)胞中表達(dá)。ASCs單獨(dú)培養(yǎng)或與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，并用IFN-γ和LPS（促進(jìn)M1表型的巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子）處理。在用IFN-γ和LPS處理的ASCs中，TSG-6表達(dá)增加了約21倍，而與M0巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的ASCs中TSG-6表達(dá)增加了約10倍。有趣的是，當(dāng)ASCs與M1巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，ASCs和M1巨噬細(xì)胞中的TSG-6 mRNA分別增加了約63倍和46倍。此外，使用小鼠巨噬細(xì)胞Raw 264.7分析了巨噬細(xì)胞對(duì)ASCs中TSG-6 的表達(dá)是否是特異性所必需的。結(jié)果表明，與由 THP-1 分化的 M1 巨噬細(xì)胞類似，用 LPS 處理的 Raw264.7 細(xì)胞顯著誘導(dǎo) ASCs 中的 TSG-6 表達(dá)。這些結(jié)果表明，如果巨噬細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞共存于炎癥或損傷部位，它們都過度表達(dá)TSG-6。

圖1   與巨噬細(xì)胞間接共培養(yǎng)的ASCs中的TSG-6 mRNA表達(dá)。ASCs與巨噬細(xì)胞間接共培養(yǎng)2天，并通過qPCR評(píng)估TSG-6 mRNA表達(dá)。

用細(xì)胞因子組合處理的 ASCs 和巨噬細(xì)胞中的 TSG-6 表達(dá)

由于巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α和IL-1β可以誘導(dǎo)TSG-6表達(dá)，因此實(shí)驗(yàn)研究了IFN-γ和LPS、TNF-α或IL-1β是否在ASCs中TSG-6表達(dá)的增加中起作用。在用IFN-γ和LPS，TNF-α或IL-1β單獨(dú)處理的ASCs中，僅在長(zhǎng)時(shí)間（300秒）后檢測(cè)到升高的TSG-6水平。然而，在用IFN-γ，LPS和TNF-α聯(lián)合處理的ASCs中，即使在短時(shí)間（22秒）也觀察到TSG-6表達(dá)顯著增加，這種增加取決于TNF-α的劑量（圖2 A，lanes 5和6），但不是 IL-1β （圖2 A，lanes 7和8）。然而，當(dāng)用四種因子處理細(xì)胞時(shí)，觀察到最大的TSG-6表達(dá)（圖2 A，lanes 9 和10）。這些結(jié)果表明，幾種炎性細(xì)胞因子的協(xié)同作用是TSG-6在ASCs中最佳表達(dá)所必需的。

相比之下，與用IFN-γ和LPS處理的細(xì)胞相比，用IFN-γ、LPS和TNF-α組合處理觀察到巨噬細(xì)胞中的TSG-6表達(dá)增加（圖2 B，lanes 5）。這些結(jié)果表明，誘導(dǎo)TSG-6表達(dá)的條件因細(xì)胞類型而異，并且ASCs可以通過比巨噬細(xì)胞更敏感地對(duì)炎癥條件做出反應(yīng)來表達(dá)TSG-6。

圖2   TSG-6在用TNF-α，IL-1β和/或IFN-γ + LPS處理的ASCs和巨噬細(xì)胞中的表達(dá)。用不同濃度的TNF-α、IL-1β和/或IFN-γ（20 ng/mL）+ LPS（10pg/mL）處理ASCs或巨噬細(xì)胞48 h，采用免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞裂解物和培養(yǎng)上清液中TSG-6表達(dá)。（A） ASCs中的TSG-6表達(dá)。（B）巨噬細(xì)胞中的TSG-6表達(dá)。

TSG-6 表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)者和轉(zhuǎn)錄激活者（STAT）信號(hào)通路的激活

接下來，研究了由IFN-γ和LPS激活的STAT通路是否參與TSG-6表達(dá)。

在ASCs和巨噬細(xì)胞中，IFN-γ + LPS處理，但不是TNF-α或IL-1β處理，誘導(dǎo)STAT1/3在15分鐘磷酸化。抑制STAT活性的Janus激酶（JAK）抑制劑降低了細(xì)胞因子聯(lián)合處理誘導(dǎo)的TSG-6表達(dá)（圖3 A）。此外，在間接共培養(yǎng)的ASCs和巨噬細(xì)胞中也觀察到TSG-6表達(dá)的降低（圖3 B、C）。這些結(jié)果表明，STAT信號(hào)通路誘導(dǎo)ASCs和巨噬細(xì)胞中的TSG-6表達(dá)。此外，STAT活性誘導(dǎo)了TNF-α + IL-1β處理過程中TSG-6的協(xié)同表達(dá)。

總之，IFN-γ + LPS、TNF-α或IL-1β可以在ASCs和巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)TSG-6表達(dá)，當(dāng)ASCs和巨噬細(xì)胞在STAT激活條件下暴露于TNF-α或IL-1β時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)TSG-6過表達(dá)。

圖3    JAK抑制劑抑制TSG-6表達(dá)。在細(xì)胞因子處理或共培養(yǎng)前20分鐘用JAK抑制劑（JAK1和JAK2抑制劑各10μM）處理細(xì)胞。刺激后48 h回收細(xì)胞裂解物，并使用免疫印跡分析TSG-6表達(dá)。（A）用TNF-α，IL-1β和/或IFN-γ + LPS處理后ASCs中的TSG-6表達(dá)。共培養(yǎng)后ASCs（B）或巨噬細(xì)胞（C）中的TSG-6表達(dá)。

TSG-6 在 ASCs 和巨噬細(xì)胞中表達(dá)的抗纖維化作用

TSG-6除了具有代表性的抗炎特性外，還可通過調(diào)節(jié)TGF-β/Smad通路來調(diào)節(jié)纖維化。因此，實(shí)驗(yàn)研究了ASCs和巨噬細(xì)胞表達(dá)的TSG-6是否可以調(diào)節(jié)TGF-β誘導(dǎo)的LX-2（人肝星狀細(xì)胞）細(xì)胞的纖維化過程。

在LX-2細(xì)胞中，TGF-β誘導(dǎo)Smad3磷酸化和α-SMA表達(dá)，TSG-6顯著降低了這些表達(dá)（圖4 A、B）。此外，TGF-β誘導(dǎo)的α-SMA表達(dá)在與ASCs和巨噬細(xì)胞間接共培養(yǎng)的LX-2細(xì)胞中顯著降低。

接下來，為了確定LX-2中α-SMA表達(dá)的降低是否依賴于ASCs和巨噬細(xì)胞表達(dá)的TSG-6，使用siRNA研究了TSG-6沉默后α-SMA的表達(dá)。結(jié)果表明，TSG-6 siRNA 處理的 ASCs 和 Raw 264.7 巨噬細(xì)胞中 TSG-6 表達(dá)顯著降低，導(dǎo)致TGF-β暴露的LX-2細(xì)胞中α-SMA表達(dá)的恢復(fù)。

這些結(jié)果表明，TSG-6可以通過抑制LX-2細(xì)胞中的Smad3磷酸化來降低α-SMA表達(dá)，ASCs和巨噬細(xì)胞表達(dá)的TSG-6調(diào)節(jié)LX-2細(xì)胞的纖維化活性。

圖4   TSG-6在TGF-β處理的LX-2細(xì)胞中的抗纖維化作用。

（A）TSG-6在TGF-β處理的LX-2細(xì)胞中抑制α-SMA表達(dá)。（B）TSG-6抑制Smad3磷酸化。下室中的LX-2細(xì)胞與接種在上室的ASCs和巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)。抑制α-SMA的表達(dá)在與ASCs和巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的LX-2細(xì)胞中（C）或ASCs和RAW 264.7巨噬細(xì)胞中（D）。

這些研究結(jié)果表明，通過激活STAT1/3增加TSG-6表達(dá)，全面的炎癥微環(huán)境可能在確定ASCs的治療特性方面發(fā)揮重要作用?？傊紤]MSC移植過程中的炎癥環(huán)境對(duì)于增強(qiáng)MSCs和巨噬細(xì)胞表達(dá)的TSG-6的抗炎和抗纖維化特性非常重要。

參考文獻(xiàn)：Gong SC, Yoon Y, Jung PY, Kim MY, Baik SK, Ryu H, Eom YW. Antifibrotic TSG-6 Expression Is Synergistically Increased in Both Cells during Coculture of Mesenchymal Stem Cells and Macrophages via the JAK/STAT Signaling Pathway. Int J Mol Sci. 2022 Oct 28;23(21):13122. doi: 10.3390/ijms232113122. PMID: 36361907; PMCID: PMC9656625.

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