骨關(guān)節(jié)炎（OA）是最常見的年齡相關(guān)性關(guān)節(jié)疾病，可引起關(guān)節(jié)疼痛和腫脹。多種因素（包括過(guò)度機(jī)械負(fù)荷和系統(tǒng)性代謝異常）有助于臨床OA的發(fā)生，但不同關(guān)節(jié)之間每種因素的權(quán)重可能不同。

在細(xì)胞水平上，骨關(guān)節(jié)炎是軟骨結(jié)構(gòu)和功能的逐漸喪失。在正常情況下，軟骨細(xì)胞分泌II型膠原蛋白和蛋白聚糖以維持軟骨基質(zhì)。然而，在OA的進(jìn)展過(guò)程中，軟骨細(xì)胞通過(guò)去分化過(guò)程發(fā)生表型變化。

OA的分子標(biāo)志是滑膜微環(huán)境中炎性細(xì)胞因子升高。這些炎性細(xì)胞因子包括IL-6和IL-8。在OA患者的滑液和血清中觀察到這兩種細(xì)胞因子水平升高。此外，IL-1β和TNFα與OA進(jìn)展有關(guān)。IL-1β和TNFα的表達(dá)被NFκB和AP-1轉(zhuǎn)錄因子激活，從而誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子和介質(zhì)（包括MMP9、MMP13和IL-6）的自分泌產(chǎn)生，進(jìn)一步刺激炎癥。

NOTCH1信號(hào)對(duì)于發(fā)育和維持干細(xì)胞至關(guān)重要。在骨骼和軟骨發(fā)育過(guò)程中，NOTCH1通過(guò)激活SOX9的表達(dá)來(lái)促進(jìn)軟骨細(xì)胞的分化。證據(jù)還顯示，NOTCH1經(jīng)常在OA軟骨的軟骨細(xì)胞中被激活。因此，NOTCH1信號(hào)的激活可能在OA的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。除了調(diào)節(jié)基質(zhì)形成外，NOTCH1還能夠維持NFκB的激活，并與滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞炎性細(xì)胞因子表達(dá)的增加有關(guān)，從而促進(jìn)OA的進(jìn)展。盡管 NOTCH1 可能參與 OA 進(jìn)展，但 NOTCH1 在軟骨細(xì)胞中的確切功能仍有待說(shuō)明。

據(jù)報(bào)道，NOTCH1是內(nèi)皮細(xì)胞中的機(jī)械力傳感器。中國(guó)臺(tái)灣省國(guó)立中正大學(xué)生物醫(yī)學(xué)系、國(guó)立嘉義大學(xué)生化科學(xué)與技術(shù)系的一項(xiàng)研究曾報(bào)道了流體剪切力誘導(dǎo)NOTCH1下游基因以及炎性細(xì)胞因子和趨化因子的立即上調(diào)。數(shù)據(jù)表明，NOTCH1信號(hào)作為一個(gè)傳感器來(lái)傳遞機(jī)械壓力，并誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞中炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。

軟骨細(xì)胞剪切應(yīng)力即時(shí)反應(yīng)基因的鑒定

為了研究機(jī)械負(fù)荷對(duì)軟骨細(xì)胞功能的影響，實(shí)驗(yàn)以低（2 dynes/cm2）或高（15 dynes/cm2）水平的平行方向流體剪切力培養(yǎng)了人軟骨細(xì)胞系SW1353。通過(guò)RNA測(cè)序確定流體剪切力處理前后的基因表達(dá)譜。

在上調(diào)基因中，80個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因在剪切應(yīng)力下表現(xiàn)出超過(guò)四倍的增加。在這些高活化的基因中，61個(gè)基因在低剪切應(yīng)力和高剪切應(yīng)力下上調(diào)（圖1 B），而僅在高剪切應(yīng)力下的SW1353細(xì)胞中，有19個(gè)基因上調(diào)超過(guò)四倍。GO富集分析表明，這些上調(diào)基因的分子功能是細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控。這些數(shù)據(jù)表明，軟骨細(xì)胞對(duì)流體剪切力應(yīng)力的主要細(xì)胞反應(yīng)是炎癥反應(yīng)的激活。

對(duì)數(shù)據(jù)集的檢查顯示，參與炎癥過(guò)程的許多基因包括幾種炎癥細(xì)胞因子和趨化因子（圖1 C）。在靜態(tài)條件下，IL-8和CCL3的表達(dá)水平極低，但在剪切應(yīng)力下2 h，兩個(gè)基因的表達(dá)水平均增加了近百倍。除IL-8和CCL3外，TNFα和CSF2在未經(jīng)處理的細(xì)胞中檢測(cè)不到，并且在施加剪切應(yīng)力后顯著增加。與TNFα表達(dá)的增加相關(guān)，TNFAIP3和TRAF1的水平也急劇增加（圖1 C）。TRAF1和TNFAIP3先前都被確定為骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)標(biāo)志物。再加上TNFα表達(dá)的增加，這些數(shù)據(jù)表明，剪切應(yīng)力激活了TNF信號(hào)傳導(dǎo)。TNFAIP3具有抑制NFκB激活和TNFα介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的功能。此外，NFκB抑制劑NFKB1A和NFKB1Z的表達(dá)也增加（圖1 C）。

圖1   鑒定SW1353中的流體剪切力應(yīng)力立即響應(yīng)基因

（A）SW1353細(xì)胞經(jīng)受低（2 dynes/cm2） 或高（15 dynes/cm2）平行流體剪切力30分鐘。（B）79和81個(gè)基因在低剪切應(yīng)力和高剪切應(yīng)力下分別上調(diào)了四倍以上。在這兩個(gè)數(shù)據(jù)集中，發(fā)現(xiàn)61個(gè)基因上調(diào)。在低剪切應(yīng)力和高剪切應(yīng)力下，下調(diào)超過(guò)4倍的基因數(shù)量分別為4個(gè)和1個(gè)。（C）顯示所選剪切應(yīng)力激活基因的表達(dá)水平。

NOTCH1誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子

除了免疫調(diào)節(jié)中的基因功能外，還發(fā)現(xiàn)JAG1和HES1表達(dá)增加（圖1 C）。鑒于JAG1是NOTCH1受體的配體，HES1是激活的NOTCH1信號(hào)通路的下游靶標(biāo)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，NOTCH1信號(hào)是由流體剪切力激活的。

以往研究表明，NOTCH1的激活與炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生有關(guān)。然而，尚不清楚NOTCH1的激活是否直接誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞中炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。為了探索這種可能性，創(chuàng)建了一個(gè)EGFP-NOTCH1 PEST結(jié)構(gòu)域刪除的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（N1C?PEST）構(gòu)建體，并在SW1353中瞬時(shí)表達(dá)EGFP-N1C?PEST以模擬NOTCH1的激活。通過(guò)RNA測(cè)序分析SW1353表達(dá)譜的變化。測(cè)序結(jié)果顯示，模擬NOTCH1激活4 h后，在SW1353中，139個(gè)基因增加4倍，6個(gè)基因表達(dá)減少（圖2 A）。對(duì)這些上調(diào)基因的分析表明，NOTCH1信號(hào)誘導(dǎo)細(xì)胞因子、干擾素、干擾素反應(yīng)基因、趨化因子和免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)因子的表達(dá)。

將NOTCH1激活基因與流體剪切力應(yīng)力數(shù)據(jù)集交叉引用表明，許多流體剪切力應(yīng)力激活基因也對(duì)NOTCH1信號(hào)有反應(yīng)。這些基因包括細(xì)胞因子IL-8和TNF以及NFκB信號(hào)調(diào)控因子NFKB1A、NFKB1Z、TNFAIP3和TRAF1（圖2 B）。這一觀察結(jié)果表明，NOTCH1的激活是流體剪切力應(yīng)力處理的直接事件，激活的NOTCH1信號(hào)反過(guò)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞因子和免疫調(diào)節(jié)因子的表達(dá)。因此，這些數(shù)據(jù)表明，NOTCH1在機(jī)械力加載的軟骨中起誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的作用。

此外，觀察到III型干擾素急劇增加，包括IFNL1、IFNL2和IFNL3（圖2 B）。許多已知干擾素反應(yīng)基因的表達(dá)也隨著干擾素產(chǎn)生的增加而增加（圖2 B）。除細(xì)胞因子外，參與免疫反應(yīng)調(diào)控的基因也上調(diào)。在這些NOTCH1激活基因中，顯著的基因是由CD274編碼的PD-L1。PD-L1是抗癌免疫治療的靶標(biāo)，但其在OA中的作用尚不清楚。

圖2   鑒定SW1353中的NOTCH1激活基因

（A）SW1353用pEGFP-C1和pEGFP-N1C?PEST轉(zhuǎn)染2小時(shí)，并在新鮮培養(yǎng)基中再孵育2小時(shí)。收獲細(xì)胞用于通過(guò)RNA測(cè)序分析基因表達(dá)。（B）NOTCH1誘導(dǎo)的基因根據(jù)其功能分為干擾素，干擾素反應(yīng)基因，細(xì)胞因子，趨化因子和免疫調(diào)節(jié)因子。

為了確認(rèn)RNA測(cè)序的結(jié)果，進(jìn)行了獨(dú)立的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，并通過(guò)定量RT-PCR檢查了IL-8、TNF、IFNB1和IFNL1的表達(dá)水平。qRT-PCR結(jié)果與測(cè)序數(shù)據(jù)一致，表明IL-8、IFNB1和IFNL1顯著增加（圖3 A）。通過(guò)ELISA測(cè)定了轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)基中IL-8的水平。結(jié)果表明，在激活的NOTCH1表達(dá)后8 h，培養(yǎng)物中IL-8蛋白水平急劇升高（圖3 B）。因此，這些數(shù)據(jù)表明，流體剪切力應(yīng)力誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)至少部分是由NOTCH1信號(hào)激活介導(dǎo)的。

圖3   通過(guò)qRT-PCR和ELISA確認(rèn)NOTCH1激活基因

（A）EGFP和EGFP-N1C?PEST在SW1353中瞬時(shí)表達(dá)。轉(zhuǎn)染開始4小時(shí)后，提取總RNA，并通過(guò)qRT-PCR分析IL-8、TNF、IFNB1和IFNL1的表達(dá)水平。（B）轉(zhuǎn)染后2小時(shí)、4小時(shí)和8小時(shí)收集培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中IL-8的水平由ELISA測(cè)定。

NOTCH1誘導(dǎo)的細(xì)胞因子對(duì)成骨細(xì)胞的影響

OA的常見癥狀是骨刺的生長(zhǎng)。一種可能性是來(lái)自軟骨細(xì)胞的NOTCH1誘導(dǎo)的細(xì)胞因子隨后影響成骨細(xì)胞的功能。為了探索這種可能性，實(shí)驗(yàn)用EGFP或N1C?PEST轉(zhuǎn)染SW1353 2小時(shí)。

在條件培養(yǎng)基下4小時(shí)，在用EGFP條件培養(yǎng)基處理的hFOB 1.19細(xì)胞中，9個(gè)基因顯示出超過(guò)四倍的增加，而9個(gè)基因顯示出超過(guò)四倍的減少。相比之下，在N1C?PEST條件培養(yǎng)基中孵育的hFOB 1.19具有28個(gè)上調(diào)基因和5個(gè)下調(diào)基因，變化大于4倍（圖4 A）。 對(duì)數(shù)據(jù)的檢查表明，這些由N1C?PEST -條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的基因在炎癥和免疫調(diào)節(jié)中起作用（圖4 B）。

圖4   通過(guò)來(lái)自N1C?PEST轉(zhuǎn)染SW1353的條件培養(yǎng)基上調(diào)成骨細(xì)胞系hFOB中的細(xì)胞因子和趨化因子

（A）在條件培養(yǎng)基下4小時(shí)，通過(guò)RNA測(cè)序分析hFOB的表達(dá)譜。（B）條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)基因根據(jù)其作為趨化因子，細(xì)胞因子和免疫調(diào)節(jié)因子的功能進(jìn)行分組。

對(duì)RNA測(cè)序數(shù)據(jù)的分析表明，在條件培養(yǎng)基下的延長(zhǎng)培養(yǎng)過(guò)程中，誘導(dǎo)基因的水平開始下降。具體來(lái)說(shuō)，CCL2在24小時(shí)后返回到未處理細(xì)胞的水平。雖然CXCL2、IFNB1和INFL1的水平?jīng)]有恢復(fù)到未經(jīng)處理的水平，但仍顯示出顯著下降（圖5 A）。另一方面，雖然用EGFP條件培養(yǎng)基處理的hFOB中，CXCL11的表達(dá)水平在延長(zhǎng)培養(yǎng)后也有所增加，但CXCL11的表達(dá)量保持在相似的水平（圖5 A）。為確認(rèn)RNA測(cè)序結(jié)果，進(jìn)行了獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，通過(guò)qRT-PCR證實(shí)了CXCL2、CXCL11、IFNB1和IFNL1的表達(dá)變化（圖5 B）。結(jié)果表明，軟骨細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子對(duì)鄰近成骨細(xì)胞具有短期刺激作用，導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子在周圍環(huán)境中進(jìn)一步積累。

圖5   通過(guò)N1C?PEST轉(zhuǎn)染的SW1353條件培養(yǎng)基激活成骨細(xì)胞系hFOB中的細(xì)胞因子表達(dá)

（A）0、4和24小時(shí)后，從條件hFOB中收集RNA并通過(guò)RNA測(cè)序進(jìn)行分析。（B）另外進(jìn)行了兩項(xiàng)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。采用qRT-PCR測(cè)定CCL2、CXCL2、CXCL11和IFNB1的表達(dá)水平。

在這項(xiàng)研究中，使用人軟骨細(xì)胞系SW1353來(lái)鑒定流體剪切力應(yīng)力-即時(shí)反應(yīng)基因。在施加剪切應(yīng)力時(shí)，NOTCH1配體JAG1和下游靶基因HES1迅速而急劇地上調(diào)，提供了獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，證明NOTCH1在軟骨細(xì)胞中被機(jī)械力激活。NOTCH1已被證明可作為內(nèi)皮細(xì)胞中的機(jī)械力傳感器。結(jié)合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，這些發(fā)現(xiàn)表明，NOTCH1在應(yīng)力承載組織中具有機(jī)械力傳感器和信號(hào)傳感器的功能。

參考文獻(xiàn)：Cheng HJ, Hsu WT, Chen CN, Li C. Activation of NOTCH1 by Shear Force Elicits Immediate Cytokine Expression in Human Chondrocytes. Int J Mol Sci. 2020 Jul 14;21(14):4958. doi: 10.3390/ijms21144958. PMID: 32674293; PMCID: PMC7404062.

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