小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的常駐巨噬細胞，參與CNS穩(wěn)態(tài)。為了應對損傷，小膠質(zhì)細胞將其狀態(tài)/極化從經(jīng)典的 M1 表型轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ畹?nbsp;M2 表型，M1表型通過分泌促炎細胞因子和活性氧、活性氮物質(zhì)對神經(jīng)元有毒性，而M2表型分泌抗炎細胞因子，具有增強的吞噬活性，并釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子。事實上，抑制促炎M1小膠質(zhì)細胞并促進它們轉(zhuǎn)變?yōu)楸Ｗo和抗炎的M2表型可能被證明是治療神經(jīng)炎癥相關(guān)疾病，如阿爾茨海默?。?/span>AD），的重要治療策略。

人脂肪組織來源的間充質(zhì)干細胞（hAD-MSCs）在臨床治療中特別有希望，因為它們可以使用微創(chuàng)技術(shù)從患者身上輕松且可重復地收集。在與AD相關(guān)的動物模型和臨床試驗中，hAD-MSCs已被證明通過調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)以及小膠質(zhì)細胞增殖，極化和吞噬活性來改善AD疾病癥狀。這種效應的機制已被證明，部分是由于MSCs通過其分泌組的旁分泌活性，包括可溶性細胞因子，生長因子和細胞外囊泡（EVs）的釋放。EVs是分泌的小（直徑約30-200 nm）脂質(zhì)囊泡，通過在細胞之間轉(zhuǎn)移RNA、DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，已成為細胞間通訊的重要介質(zhì)。最近的研究表明，EVs還可以將小膠質(zhì)細胞從M1極化為M2表型。鑒于EVs具有低免疫原性，因此它們作為潛在的無細胞療法具有巨大潛力。

目前，很少有研究通過關(guān)注其免疫調(diào)節(jié)表型來研究人類小膠質(zhì)細胞中hAD-MSCs及其分泌的EVs的潛在機制。鑒于小鼠炎癥模型中的基因組反應與人類基因組變化沒有很好的相關(guān)性，美國斯坦福大學放射學系的課題組研究了hAD-MSCs及其EVs在人小膠質(zhì)細胞系（人小膠質(zhì)細胞HMC3）中的作用。

脂多糖（LPS）對HMC3細胞的影響

為了評估不同程度的toll樣受體4（TLR4）激活的效果，將HMC3細胞與增加濃度（0.01-10 μg/ml）的脂多糖（LPS）孵育24小時。在低濃度的LPS下，HMC3細胞具有激活小膠質(zhì)細胞的特征，呈阿米巴樣形態(tài)（圖1 A、B）。此外，LPS增加了小膠質(zhì)細胞的β-整合素標志物 CD11b的表達（圖1 B）。雖然在低濃度（0.1-1 μg/ml）的LPS下存在小膠質(zhì)細胞活化，但較高濃度（10 μg/ml）可導致細胞死亡（圖1 B）。數(shù)據(jù)顯示，即使在較低濃度 ≤1 μg/ml下，LPS誘導的細胞內(nèi)活性氧（ROS）也會積累（圖1 D）。為了進一步了解炎癥對HMC3細胞的影響，測量了1 μg/ml LPS處理和對照細胞的條件培養(yǎng)基中細胞因子和趨化因子的相對表達（圖1 E、F），在這里，單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）、白細胞介素6（IL-6）和IL-8在LPS激活后均增加。

圖1   LPS對HMC3小膠質(zhì)細胞的影響

（A）顯示了用不同劑量的LPS孵育24小時后HMC3小膠質(zhì)細胞的形態(tài)變化。（B）對CD11b（綠色熒光信號）、鬼筆環(huán)肽（白色）和核DAPI染色（藍色）進行免疫熒光染色。（C）用不同劑量的LPS孵育24小時后的細胞活力通過XTT測定法測定。（D）使用Celigo成像細胞儀確定響應24小時LPS暴露的HMC3小膠質(zhì)細胞中LPS誘導的ROS生成。（E）相對細胞因子表達的熱圖。（F）相對細胞因子表達的表征。

hAD-MSCs及其分泌的EVs的表征

hAD-MSCs具有典型的MSC紡錘形和多極形態(tài)。為了確定hAD-MSCs分泌的EVs的作用，實驗收集了條件培養(yǎng)基和EVs。蛋白質(zhì)印跡分析顯示，與細胞裂解物相比，分離的EVs和CM中的CD63（經(jīng)典EVs標志物）富集。

分析來自hAD-MSCs的分泌組，顯示TIMP-1、IL-6和IL-8的表達增加，事實上，與親本間充質(zhì)干細胞相比，這些細胞因子在EVs中高度表達。

HMC3細胞與hAD-MSC或其分泌的EVs共培養(yǎng)

未處理和激活的（1μg/ml LPS）HMC3細胞與不同比例的hAD-MSCs和EVs共培養(yǎng)24小時（圖2 A）。當未經(jīng)處理的HMC3細胞與hAD-MSCs共培養(yǎng)時，它們顯示出典型的細長、分枝狀小膠質(zhì)細胞靜息形態(tài)，類似于上述對照實驗（圖1 A）。添加LPS（1 μg/ml）導致HMC3細胞形成阿米巴樣形態(tài)，與200，000和100，000個hAD-MSCs細胞（圖2 B）或 20 和 10 μg/ml 的 EVs（圖2 C）共培養(yǎng)時，阿米巴樣形態(tài)細胞的數(shù)量顯著減少。

圖2   人HMC3小膠質(zhì)細胞與人脂肪組織來源間充質(zhì)干細胞或細胞外囊泡的共培養(yǎng)

（A）共培養(yǎng)方案的示意圖概述。（B）在存在或不存在 1 μg/ml LPS 的情況下培養(yǎng) HMC3 小膠質(zhì)細胞（綠色）和人脂肪組織來源的間充質(zhì)干細胞（紅色）的熒光圖像。（C）在存在或不存在 1 μg/ml LPS 的情況下培養(yǎng)的 HMC3 小膠質(zhì)細胞（綠色）和人脂肪組織來源的間充質(zhì)干細胞細胞外囊泡（紅色）的熒光圖像。

激活的HMC3細胞與hAD-MSCs或其分泌的EVs共培養(yǎng)后的表征

為了研究對小膠質(zhì)細胞表型極化的影響，用1 μg/ml LPS激活HMC3細胞24小時，然后與hAD-MSCs或其分泌的EVs共培養(yǎng)。實驗對CD11b進行了免疫熒光染色，CD11b可檢測F-肌動蛋白（圖3 A）。如前所述，與未處理的HMC3細胞相比，LPS處理上調(diào)了CD11b表達和阿米巴樣形態(tài)。然而，當活化的小膠質(zhì)細胞與hAD-MSCs或其EVs共培養(yǎng)時，CD11b表達降低，阿米巴樣形態(tài)24小時后可見（圖3 A）。

LPS激活后，HMC3細胞中誘導的一氧化氮合酶（iNOS）的量顯著增加，從1.49增加到98.51（圖3 B、C）。相反，在存在hAD-MSCs和hAD-MSC EVs的情況下，在所有比率下，iNOS的水平均顯著降低（圖3 C）。此外，觀察到標記的酵母聚糖顆粒被用LPS處理的HMC3細胞吞噬。然而，當HMC3細胞與hAD-MSCs共培養(yǎng)時，這種效應受到抑制，但當它們與hAD-MSC EVs共培養(yǎng)時，這種效應不受抑制。

圖3   hAD-MSCs對小膠質(zhì)細胞免疫炎癥表型的影響

（A）M1 標記物 CD11b（綠色）、F-肌動蛋白鬼筆環(huán)肽（白色）和 DAPI（藍色）的免疫熒光染色。hAD-MSCs用CellBrite Orange （紅色）標記。（B）誘導性一氧化氮（iNOS）的蛋白質(zhì)表達水平。（C）蛋白質(zhì)印跡定量。iNOS誘導型一氧化氮。

激活的HMC3細胞分泌細胞因子

在存在或不存在hAD-MSCs或EVs的情況下，實驗確定了HMC3激活或非激活小膠質(zhì)細胞中的細胞因子分泌（圖4 A、B）。LPS激活HMC3細胞后，與未處理的小膠質(zhì)細胞相比，IL-6增加了四倍，IL-8增加了五倍（圖4 C-F）。用hAD-MSCs處理減弱了激活的小膠質(zhì)細胞中IL-8以及IL-6的分泌（圖4 C、E）。相比之下，在hAD-MSC EVs存在的情況下，IL-8或IL-6的分泌上調(diào)（圖4 D、F）。同樣，HMC3細胞的活化導致MCP-1增加兩倍，hAD-MSCs（50，000個細胞）和hAD-MSC EVs（50和20 μg/ml）均降低MCP-1，且EVs的作用更大（圖4 D、F）。此外，在活化小膠質(zhì)細胞中，TIMP-1的蛋白質(zhì)水平也被EVs顯著上調(diào)，并通過高hAD-MSCs劑量（200，000和100，000個細胞）下調(diào)，而IL-10水平被更高劑量的hAD-MSCs EVs（50和20 μg/ml）上調(diào)。BDNF蛋白表達也被EVs上調(diào)，并通過所有hAD-MSCs劑量下調(diào)（圖4 E、F）。

圖4   由人脂肪組織間充質(zhì)干細胞和細胞外囊泡介導的未經(jīng)處理或LPS刺激的HMC3小膠質(zhì)細胞中細胞因子產(chǎn)生的變化

（A）細胞因子陣列的基因圖譜。（B）共培養(yǎng)細胞因子陣列和人脂肪組織來源的干細胞或細胞外囊泡的圖像。（C、D）相關(guān)細胞因子表達的熱圖。（E、F）細胞因子的相對表達。

總之，該研究證明了hAD-MSCs及其分泌的EVs可以預防促炎小膠質(zhì)細胞表型。這些發(fā)現(xiàn)支持hAD-MSC EVs作為治療包括AD在內(nèi)的神經(jīng)炎癥性疾病的潛在無細胞療法的作用。未來需要進一步的研究來確定hAD-MSC分泌的EVs的含量及其作用的不同分子機制，以了解它們?nèi)绾卧诩毎囵B(yǎng)和動物模型中精確調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞。

參考文獻：Garcia-Contreras M, Thakor AS. Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells and their extracellular vesicles modulate lipopolysaccharide activated human microglia. Cell Death Discov. 2021 May 10;7(1):98. doi: 10.1038/s41420-021-00471-7. PMID: 33972507; PMCID: PMC8110535.

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