細胞株開發(fā)簡述：
可靠生產(chǎn)工藝的基礎(chǔ)
近年來，全球生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展正處于快速上升期，醫(yī)藥健康行業(yè)也將迎來新一輪的變革與機遇。其中，細胞與基因治療藥物、抗體藥物書寫創(chuàng)新生物藥新篇章，被認為是未來醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)展的主力軍。但無論是抗體藥物的生產(chǎn)還是基于病毒載體的基因治療藥物的制備，都離不開穩(wěn)定高效的細胞株開發(fā)。
▲ Global Market Insights數(shù)據(jù)預(yù)測：CLD市場報告[1]
據(jù)Global Market Insights數(shù)據(jù)預(yù)測，CLD市場規(guī)模在2021年約為58億美元，預(yù)計從2022年到2028年將以每年約10.1%的復(fù)合年增長率增長，到2028年將達到約117億美元。
CLD作為生物藥CMC的起點和基礎(chǔ)，構(gòu)建一個適合于生產(chǎn)的高表達穩(wěn)定細胞株至關(guān)重要，因為其在很大程度上決定了藥物開發(fā)的效率和成本。
CLD與古法造紙過程類似，成本昂貴、耗時長，開發(fā)流程如同雕版印刷中的勾刻印繪裱，每個步驟都涉及復(fù)雜而精細的生物分析和質(zhì)量研究工作，并且需要優(yōu)化的細胞培養(yǎng)工藝，以確保能夠成功進行商業(yè)生產(chǎn)。
在CLD早期工藝開發(fā)階段增強對未來潛在挑戰(zhàn)的認識有助于降低失敗風(fēng)險，減少重復(fù)工藝相關(guān)費用，并確保最終的生物藥滿足監(jiān)管要求。目前，CLD面臨著一些技術(shù)上的關(guān)鍵挑戰(zhàn)，例如大批量克隆篩選、早期表征分析和優(yōu)化以及可擴展性、細胞株穩(wěn)定性等。
面對不同的生物藥開發(fā)，如何實現(xiàn)高效、高質(zhì)量的CLD？在工藝上又可以通過哪些手段或方案來滿足預(yù)期的商業(yè)化需求？下面就讓小編給大家細細道來。
不斷優(yōu)化的技術(shù)流程
自漢朝發(fā)明紙張以后，書寫材料比起過去用的甲骨、簡牘、金石和縑帛要更輕便、更經(jīng)濟，但流程仍復(fù)雜，成本較高，雕版印刷技術(shù)的出現(xiàn)改變了這一現(xiàn)狀，標準化雕刻了反體字的模板與近乎透明的稿紙正面相貼，大大提升了原始手抄經(jīng)書的速度，且筆畫清晰可辨。
目前CLD的標準流程步驟包括：基因克隆和初始克隆篩選、克隆篩選和驗證分析、細胞培養(yǎng)及培養(yǎng)基優(yōu)化、評估和表征分析以及最后的細胞庫建立。整個開發(fā)周期一般需要12-18個月，對標準化流程中的每一步工藝改進都將影響CLD整體進程。
▲ 高效細胞株開發(fā)工藝流程
1、初始克隆篩選——全流程開發(fā)的基石
雕版印刷術(shù)的第一步是選擇合適的木板，厚度和硬度都是成功的關(guān)鍵屬性，而CLD的第一步需要考慮采用何種表達體系。
宿主細胞系直接影響產(chǎn)品的特定屬性，比如糖基化、羧基化、羥基化、酰胺化等；甚至還可能影響半衰期、免疫原性和生物學(xué)活性。宿主細胞系應(yīng)有完整表征以及完整的記錄，并不含TSE/BSE等病毒污染因f素。另外，宿主細胞還應(yīng)適合無血清培養(yǎng)基，或者無動物來源成分的培養(yǎng)基中懸浮生長。
近年來，隨著技術(shù)的發(fā)展以及研究的深入，有超過75.6%的生物藥采用哺乳動物細胞表達體系，其包括人源細胞和非人源細胞，其中在這部分里有超過83%的生物藥采用了非人源細胞系的CHO(Chinese hamster ovary)細胞進行CLD。
▲ 2014-2020年獲批的生物制劑應(yīng)用的細胞表達體系比例
據(jù)統(tǒng)計，在2015年后獲批的藥物中，CHO細胞表達體系占據(jù)超過一半的比例。主要原因有三點：
CHO細胞在生物藥生產(chǎn)中應(yīng)用早、表達量高、容易處理和操作以及法規(guī)接受程度高；
CHO細胞還具有較高的基因和表型不穩(wěn)定性，有著較多的細胞譜系，例如DG44、DXB11、CHO K1、CHO-S等；
致病性的病毒在CHO細胞中無法復(fù)制，因此CHO細胞被認為是非常安全的表達體系。
此外，初始克隆階段能夠以快速度鑒定細胞活力，從數(shù)以千計的克隆中找到穩(wěn)定、高產(chǎn)的克隆將為后續(xù)流程奠定基礎(chǔ)。
Octet®分子互作分析系統(tǒng)采用生物層干涉（BLI）技術(shù)，是一種無標記的、實時監(jiān)測的技術(shù)，主要用于生物分子間相互作用動力學(xué)參數(shù)及蛋白濃度測定。使用Octet®，能夠?qū)兓臉悠泛彤愘|(zhì)的粗樣品裂解液中的IgG 濃度進行量化，最多可選96通道，10分鐘內(nèi)檢測一塊384孔板。
2、目標蛋白表達——多方向考量與調(diào)整
從技術(shù)層面上分析，印刷術(shù)采用的字模材料主要是木和泥，經(jīng)過多次使用，排字行距就變得歪斜不整齊。再加上本來字模手工雕刻導(dǎo)致的字體、大小、筆畫粗細不一，失誤導(dǎo)致的字體顛倒、錯字等，因此需要選擇合適的墨水和雕刻手法。
CLD的開發(fā)同樣如此，在選擇好合適的表達體系后，下一步的關(guān)鍵是讓核酸進入細胞并表達目的蛋白——轉(zhuǎn)染。
轉(zhuǎn)染是一種重要的重組DNA技術(shù)，其可將編碼目的蛋白產(chǎn)物基因與表達載體結(jié)合并插入細胞基因組。其中，載體是能夠自主復(fù)制的DNA元件。載體中不僅包含轉(zhuǎn)入的外源基因，還包括一些用于優(yōu)化蛋白質(zhì)表達過程和緩解沉默效應(yīng)的表達元件。選擇標記基因的主要目的是加快遺傳載體在宿主細胞系中的表達。用于CHO細胞的經(jīng)典選擇標記包括谷氨酰胺合成酶（GS）和二氫葉酸還原酶（DHFR）。
▲ 生物分子的表達載體和轉(zhuǎn)染流程（圖片來源：參考資料3）
目前轉(zhuǎn)染方法包括基于試劑的方法、基于儀器的方法和病毒介導(dǎo)法：
這里，應(yīng)該注意的是，沒有一種方法適用于所有的細胞和實驗，在選擇轉(zhuǎn)染方法時，需要考慮細胞類型、產(chǎn)品表達量需求、安全性、經(jīng)濟性、工藝放大、周轉(zhuǎn)時間和法規(guī)要求等多方面因素。理想的方法應(yīng)具有高轉(zhuǎn)染效率，低細胞毒性和對正常生理學(xué)的影響最小，并且易于使用和具有可重復(fù)性等特點。目前常用于哺乳動物細胞轉(zhuǎn)染的方法有磷酸鈣法、陽離子脂質(zhì)體法、病毒轉(zhuǎn)染法和電穿孔法。
另外，在轉(zhuǎn)染過程中，化學(xué)限定的細胞培養(yǎng)基已經(jīng)成為當(dāng)下CHO細胞生產(chǎn)工藝的金標準。
在有關(guān)CHO培養(yǎng)基和克隆篩選方法的對比分析的研究中，研究人員運用培養(yǎng)基基準測試并充分利用Ambr® 15微型生物反應(yīng)器平臺進行克隆/培養(yǎng)基各種組合的培養(yǎng)基篩選，在相同大小、多并行的生物反應(yīng)器中比較培養(yǎng)物，建立多個實驗以評價不同的細胞系或克隆，并研究工藝參數(shù)的影響，例如溫度、補料、培養(yǎng)基成分、通氣量和接種密度。
并使用Octet®非標記分子互作分析系統(tǒng)對其進行滴度、結(jié)合活性以及糖基化分析等一系列檢測。
結(jié)果顯示結(jié)果顯示，4Cell® XtraCHO培養(yǎng)基，在細胞生長、存活率、產(chǎn)量、糖基化分析方面，性能優(yōu)于對照組培養(yǎng)基（詳見文章：高效細胞株開發(fā)：高通量細胞培養(yǎng)及滴度測定）。
3、細胞篩選和評估
雕版印刷肇始于隋，行于唐世，在不斷使用過程中人們逐漸發(fā)現(xiàn)其局限性，那就是發(fā)現(xiàn)錯別字時改起來很困難，常需整塊版重新雕刻，因此活字印刷術(shù)被發(fā)明，大大地加快了精準度和制版時間。現(xiàn)代CLD細胞培養(yǎng)的過程中同樣能夠通過高通量分析和篩選技術(shù)精準、高效地發(fā)現(xiàn)目標細胞，并為下游工藝未雨綢繆。
通常，細胞轉(zhuǎn)染之后最終的生產(chǎn)克隆中會整合幾十到數(shù)千個目的基因拷貝，所以很難確定整合的質(zhì)粒數(shù)是否可以達到預(yù)期的最佳值。而且，目的基因會選擇性標記在宿主細胞基因組中以隨機方式進行穩(wěn)定整合，故無法準確預(yù)測整合效果。因此，按照此流程選擇的Minipool實際上是異質(zhì)的混合細胞群體，這些細胞在整合轉(zhuǎn)基因的數(shù)量和定位方面可能有明顯差異，故細胞比生產(chǎn)率（Qp）也可能各不相同。
為了提高高表達細胞出現(xiàn)的概率，可以采用“批量分揀法”富集穩(wěn)定高產(chǎn)的Minipool。由于早期Minipool的蛋白分泌較少，富集在上清里面的蛋白含量極低，故傳統(tǒng)方法在速度及數(shù)據(jù)準確度上都難以實現(xiàn)。
iQue®高通量流式細胞儀能夠快速監(jiān)測細胞健康和活力，使用人IgG滴度和活力分析試劑盒可以很好地評估懸浮CHO細胞，同時定量測定其分泌蛋白，以快速識別先導(dǎo)克隆，在短時間內(nèi)增加克隆評估數(shù)量，5分鐘內(nèi)完成一塊96孔板檢測。
ForeCyt®軟件上的Panorama功能具有動態(tài)多板數(shù)據(jù)分析能力，包括可以用戶自定義標準的圖譜，用于檢測和識別包含所需IgG同種型抗體濃度和細胞健康的樣品，這在多板篩選分析時非常重要。小鼠IgG亞型和產(chǎn)量檢測能夠簡化和加速抗體發(fā)現(xiàn)的工作流程，這意味著更短的時間獲得更多的分析結(jié)果。具體而言，將穩(wěn)定的Minipool與采用熒光標記的親和分子或特異性抗IgG抗體一起孵育，以表征細胞表面上分泌的重組蛋白量，從而能夠識別和富集高產(chǎn)Minipool。
由于監(jiān)管機構(gòu)僅接受采用單克隆細胞生產(chǎn)生物藥，這意味著生產(chǎn)所用細胞必須是從單個細胞克隆而來的均一細胞，因此需要進一步對Minipool進行單克隆化和選擇適于大規(guī)模生產(chǎn)的克隆。
4、單細胞克隆
活字印刷術(shù)由于手工制作的原因，單字之間存在個體差異，經(jīng)過篩選出來的Minipool同樣存在這類問題甚至更加嚴重，可能其中的每個細胞都具有特別的遺傳和表型特征。
單克隆性不足可能引發(fā)一些問題，例如：生長速率、代謝特征、重組蛋白Qp穩(wěn)定性、產(chǎn)品質(zhì)量等方面的差異。若Minipool由生長速率（μ）和Qp有微小差異的細胞組成，則μ高的低產(chǎn)Minipool將逐漸在數(shù)量上超過μ低的高產(chǎn)細胞群。據(jù)報道，這種情況下僅9%的生長優(yōu)勢便足以使細胞在25代內(nèi)出現(xiàn)過度增殖，這意味著工業(yè)生產(chǎn)必需采用基因和表型方面高度均一化的單克隆。
因此，需要采用先進的技術(shù)手段以該類Minipool的單個細胞為起點進行克隆，以確保生產(chǎn)用的所有細胞均來自單個細胞。對選定的Minipool進行克隆、培養(yǎng)和評估，在多次迭代選擇之后，最終的細胞庫由具有相同遺傳學(xué)特征的細胞（克隆群體）組成。目前，常用的細胞單克隆方法包括但不限于以下四種：傳統(tǒng)的有限稀釋法（LDC）、基于熒光激活細胞分選技術(shù)（FACS）、高通量自動化顯微技術(shù)、自動化克隆系統(tǒng)等。
作為LDC或FACS單細胞分選技術(shù)的主要替代方法，CellCelector平臺可實現(xiàn)高精度、高通量的單細胞及克隆篩選。通過結(jié)合高精度的機械臂技術(shù)及優(yōu)化的采集模塊，能夠自動進行排序及篩選，實現(xiàn)基于圖像的單克隆性證明和克隆活力評估，同時準確分離出完整的高活率單細胞、貼壁克隆等，提高CLD效率。
此外，因為涉及產(chǎn)品的安全性，細胞的單克隆源性驗證在確保生物制藥產(chǎn)品的純度和均一性上至關(guān)重要，因此FDA的政策和法規(guī)都強制要求生物制藥企業(yè)提供清晰圖片證據(jù)，用以證明單克隆生物藥研發(fā)過程中的單克隆源性。
▲ 克隆篩選（圖片來源：參考資料5）
另外，早期克隆篩選的通量很高，因此必須有一個運行非常平穩(wěn)和高效的優(yōu)化過程，包括細胞計數(shù)和滴度測定的適當(dāng)方法，而這些方法都需與高通量兼容。這意味著必須確保篩選了足夠數(shù)量的克隆，才能得到真正想要的類型。
Octet®分子互作分析系統(tǒng)不僅能夠快速定量粗提物中的蛋白，而且擁有針對檢測ProteinA、HCP殘留、唾液酸含量以及甘露糖含量的商業(yè)試劑盒，用戶可以在早期CLD階段快速篩選出高質(zhì)量細胞株，也可以在Octet®系統(tǒng)上輕松開發(fā)項目所需的高靈敏度定量分析方法。
接下來，完成克隆篩選后，需要進一步驗證生物藥產(chǎn)品的生物活性、功效及關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA），這些關(guān)鍵信息將為下一步實驗開展及工藝開發(fā)提供重要指導(dǎo)。Octet®分子互作分析系統(tǒng)可以進一步對生物藥產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）進行評價，得到優(yōu)單克隆細胞株。
5、細胞培養(yǎng)和培養(yǎng)基優(yōu)化
挑選到理想的高表達克隆后，就要開始選擇商業(yè)化培養(yǎng)基或者定制培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)優(yōu)化。高通量、標準化、自動化的細胞培養(yǎng)和工藝優(yōu)化能幫助我們在獲得更準確結(jié)果的同時加速細胞株開發(fā)進度。
另外，在生物藥項目開發(fā)之初及時采用自動化和高通量平臺，還能以可追溯的方式簡化優(yōu)化策略，通過促進多個參數(shù)的平行評估，使得從研究規(guī)模到商業(yè)規(guī)模的條件保持一致，顯著提高細胞株開發(fā)效率。
傳統(tǒng)的搖瓶培養(yǎng)篩選方法，因為無法提供一個良好穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，導(dǎo)致工藝放大性差，頻繁出現(xiàn)錯篩和漏篩的情況，最終產(chǎn)生大量無效重復(fù)的工作，在一定程度上延長了CLD周期，Ambr®15高通量微型生物反應(yīng)器系統(tǒng)，采用與玻璃罐反應(yīng)器相似的物理設(shè)計以及配套的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，可以高效準確獲取克隆的真實性能。
6、評估和表征分析
在整個生藥物開發(fā)過程中，應(yīng)持續(xù)對抗體進行表征分析，以確保滿足生物安全法規(guī)，并確保產(chǎn)品的性能符合預(yù)期。
Octet®BLI系統(tǒng)作為高通量非標記分子互作平臺，不僅可以進行滴度檢測，還可以對抗體進行一系列的表征分析，提供詳細的表征分析說明書，加快藥物申報上市的速度。
除此之外，還需對所選細胞進行嚴格細致的測試，以保證其遺傳穩(wěn)定性，并確保其不含任何病原體及其它未知因子。
Summary
從雕版到活字，印刷術(shù)的發(fā)展為CLD流程開發(fā)提供了直接的經(jīng)驗性啟示。未來仍需要在發(fā)展的過程中不斷優(yōu)化CLD的流程。除了采取不同的優(yōu)化策略，穩(wěn)定高效的CLD還需要開發(fā)更加先進設(shè)備。不久前，賽多利斯發(fā)布了有關(guān)CLD的白皮書，其概述了CLD工藝流程以及生物制藥公司在建立CLD流程時面臨的關(guān)鍵挑戰(zhàn)和優(yōu)化策略，以幫助有CLD需求的生物制藥公司了解更多工藝細節(jié)。
-參考文獻-
https://www.gminsights.com/industry-analysis/cell-line-development-market-report
https://www.researchgate.net/publication/291950333_Challenges_of_glycosylation_analysis_and_control_An_integrated_approach_to_producing_optimal_and_consistent_therapeutic_drugs
https://www.researchgate.net/publication/350861457_Recent_advances_in_CHO_cell_line_development_for_recombinant_protein_production
張愛龍《提升高產(chǎn)細胞株篩選效率，助力基因治療、抗體藥物等工藝開發(fā)——單細胞打印機（附案例分享）》
孤毒藥師《CMC基石：生物制劑生產(chǎn)中的細胞株開發(fā)流程》
Biopharmaceutical Processing: Development, Design, and Implementation of Manufacturing processes. Günter Jagschies, Eva Lindskog, Karol ??cki, Parrish Galliher. 2018
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