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HB180502

TRITC Phalloidin 羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽

產(chǎn)品信息

背景描述

鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）是一種來源于毒蕈類鬼筆鵝膏（Amanita phalloides）的環(huán)狀七肽毒素，以高親和力（Kd= 20 nM） 選擇性結(jié)合于絲狀肌動蛋白 F-actin，而不會與單體肌動蛋白 G-actin 結(jié)合，通常用來標(biāo)記組織切片，細(xì)胞培養(yǎng)物或無細(xì)胞體 系中的 F-actin，從而對 F-actin 進(jìn)行定性和定量分析。另外，鬼筆環(huán)肽衍生物也以相近的親和力結(jié)合于大小纖維，無論是動 植物來源的肌肉細(xì)胞或非肌肉細(xì)胞，按照每一個肌動蛋白亞基約與一個鬼筆環(huán)肽分子的計量比結(jié)合。且非特異性結(jié)合幾乎可 忽略，染色區(qū)域和非染色區(qū)域辨識度非常明顯。因此，鬼筆環(huán)肽衍生物特別適合替代肌動蛋白（Actin）抗體進(jìn)行相關(guān)研究。 另外鬼筆環(huán)肽衍生物很小，直徑約 12-15?，分子量＜2000 Daltons，未標(biāo)記肌動蛋白（Actin）的許多生理特性都得以維持， 比如，同肌動蛋白結(jié)合蛋白如肌球蛋白，原肌球蛋白，DNase I 等仍能發(fā)生反應(yīng)；鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的纖維絲仍可穿透固相肌球 蛋白基質(zhì)；以及甘油抽提的肌纖維標(biāo)記后仍可收縮等。

鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）的結(jié)合阻止絲狀肌動蛋白（微絲）的解離，穩(wěn)定微絲結(jié)構(gòu)，從而破壞微絲的聚合-去聚合的動態(tài) 平衡。此特性使得肌動蛋白聚合發(fā)生的臨界濃度（CC）降至＜1 µg/mL，因此，可用作一種聚合促進(jìn)劑。此外，鬼筆環(huán)肽還 可抑制 F-actin 的 ATP 水解活性。

本品為 TRITC（四甲基異硫氰酸羅丹明）標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽，染色反應(yīng)特異性強(qiáng)，對比性高，具有比 Actin 抗體更好的染 色效果，適合用作 F-actin 的定性和定量檢測。另外，經(jīng)本品結(jié)合后的 F-actin 仍能維持 actin 自身具有的許多生物學(xué)特性。 且本品的結(jié)合沒有物種差異性，適用性廣泛。

我司分別提供凍干粉形式（貨號：40734ES80）和儲存液形式（貨號：40734ES75，濃度為 20 µM）的 TRITC 標(biāo)記鬼筆 環(huán)肽，用戶根據(jù)自身需求選擇。建議使用濃度為 80~200 nM。

產(chǎn)品性質(zhì)

運(yùn)輸與保存方法

冰袋運(yùn)輸。-20℃避光干燥保存， 1年有效。

注意事項

1） 鬼筆環(huán)肽具有毒性，需小心操作（對人的半數(shù)致死劑量 LD50 約 2 mg/kg）。

2） 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

需要自備材料

1） （可選）甲醇

2） 1×PBS 緩沖液, pH 7.4, 細(xì)胞培養(yǎng)級別（貨號：60145ES76）

3） 固定液 4%多聚甲醛（溶于 PBS 緩沖液）（貨號：36314ES60）

4） 丙酮或透化液 0.5% Triton X-100（溶于 PBS 緩沖液）

5） Fluoromount-GTM   水溶性封片劑（不含 DAPI）（貨號：36307ES08），DAPI（貨號：40727ES10）

6） （可選）DAPI Fluoromount-GTM  水溶性封片劑（含 DAPI）（貨號：36307ES08）

7） （可選）BSA，標(biāo)準(zhǔn)級別（貨號：36101ES25）

8） 載玻片和蓋玻片

9） 蓋玻片周圍密封液（如透明指甲油）

10）組裝有 TRITC 激發(fā)/發(fā)射濾片，以及 DAPI 激發(fā)/發(fā)射濾片的熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡。

操作步驟

1.工作液準(zhǔn)備

1）對于 TRITC 標(biāo)記鬼筆環(huán)肽（貨號：40734ES75，300T）

本品以溶于甲醇的 20 µM 儲存液形式提供，總量為 300 µL。按照 100 nM 的工作液濃度來換算，可制備總量為 60 mL 的工 作液。建議收到產(chǎn)品后，根據(jù)單次使用量，對母液進(jìn)行小量分裝，-20℃避光凍存，一年穩(wěn)定。

開始實驗前，使用 1×PBS 緩沖液稀釋儲存液到需要的工作濃度。推薦工作濃度為：80~200 nM。工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。

2）對于 TRITC 標(biāo)記鬼筆環(huán)肽（貨號：40734ES80，1mg）

本品以凍干粉形式提供，分子量為 1231.4，總量為 1 mg?？上扔眉状蓟蛘?DMSO 充分溶解配制成 20~100 µM 的儲存液。 如，加入 8.1208 mL 甲醇到 1 mg 鬼筆環(huán)肽即得到 100 µM 等量的儲存液，根據(jù)單次使用量，進(jìn)行小量分裝，-20℃避光凍 存，一年穩(wěn)定。

開始實驗前，使用 1×PBS 緩沖液稀釋儲存液到需要的工作濃度。推薦工作濃度為：80~200 nM。工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.染色步驟

1）細(xì)胞爬片生長 24 h，使其密度達(dá)到 50%匯合度。

2）吸掉培養(yǎng)液，37℃預(yù)熱的 1×PBS（pH 7.4）清洗細(xì)胞 2 次。

3）使用溶于 PBS 的 4%進(jìn)行細(xì)胞固定，室溫固定 10 min。

【注】避免固定劑中含有甲醇成分，因為甲醇在固定過程中可能破壞肌動蛋白。

4）室溫條件下，用 PBS 清洗細(xì)胞 2~3 次，每次 10 min。

5）室溫條件下，用丙酮（≤-20℃）脫水或者用 0.5% Triton X-100 溶液透化處理 5 min。

6）室溫條件下，用 PBS 清洗細(xì)胞 2~3 次，每次 10 min。

7）取 200 µL 配制好的 TRITC 標(biāo)記鬼筆環(huán)肽工作液，覆蓋住蓋玻片上的細(xì)胞，室溫避光孵育 30 min（通常情況下，4℃~37℃ 孵育皆可）。

【注】為了降低背景，可于 TRITC 標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽工作液內(nèi)加入 1% BSA；另外，孵育過程中為了避免溶液揮發(fā)，可 將蓋玻片轉(zhuǎn)移到一個密封的容器內(nèi)。

8）用 PBS 清洗蓋玻片 3 次，每次 5 min。

9）使用 200 µL DAPI 溶液（濃度：100 nM）對細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染，約 30 s。

10）用 PBS 清洗蓋玻片，然后倒置在已經(jīng)滴有一滴 Fluoromount-GTM 水溶性封片劑的載玻片上。使用紙巾輕輕檫掉多余封 片劑，然后用指甲油*封片。此法制備的標(biāo)本玻片可置于 4℃避光保存，通常 6 個月內(nèi)可繼續(xù)做 F-actin 染色分析。

【注】也可以直接使用含有 DAPI 的抗熒光淬滅封片劑（貨號：36308ES11）合并步驟 9）10），簡化步驟。

11）熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下進(jìn)行熒光觀察，選擇 TRITC 激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=545/570 nm）和 DAPI 激發(fā)/發(fā)射濾 片（Ex/Em=364/454 nm）。