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abccom一抗與二抗的區(qū)別
閱讀：2096 發(fā)布時間：2019-10-11 一、抗體原理：
ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體——聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實際應(yīng)用中，通過不同的設(shè)計，具體的方法步驟可有多種。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。
二、抗體的定義：
指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。這種反應(yīng)既可在機體內(nèi)進行，也可以在機體外進行?？乖贵w反應(yīng)的過程是經(jīng)過一系列的化學(xué)和物理變化，包括抗原抗體特異性結(jié)合和非特異性促凝聚兩個階段，以及由親水膠體轉(zhuǎn)為疏水膠體的變化。多見的是“三抗”陽性：“抗-HBs+、抗-HBe、和抗- HBc+”，這說明乙肝病毒感染結(jié)束，體內(nèi)病毒清除，提示這個人免疫功能十分正常，可以獻血，也可以應(yīng)用他的血價乙肝免疫球蛋門（HBIG），用于對乙肝的防治。二抗陽性”即“抗-HBs+和抗-HBe+”或“抗-HBs+和抗-HBc+”
三、種屬區(qū)別：
（1）第yi抗體就是平常所說的抗體，即能和抗原特異性結(jié)合。第二抗體是能和抗體結(jié)合的，即抗體的抗體。主要用于檢測抗體的存在。一抗是針對抗原的抗體，二抗是針對一抗的抗體。即抗體也可以充當抗原刺激機體產(chǎn)生抗體。也就是說，抗原進入機體刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，由B細胞可以產(chǎn)生與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的特殊蛋白質(zhì)。一抗二抗都是一種可以特異結(jié)合別的物質(zhì)的基團，而且一抗可以至少結(jié)合兩種其他基團（底物和二抗）。
（2）二抗：一般來說，不同的種屬來源與二抗的質(zhì)量沒有必然的，來源于山羊的二抗與來源于驢的二抗在一般的實驗里沒有太多的差別。然而在一些特殊的實驗里， 如雙標實驗里，如果其中一個一抗是山羊來源的，一個是小鼠來源的，則相應(yīng)的二抗分別要抗山羊和抗小鼠的二抗，這時候，二抗就不能選擇山羊或者小鼠來源的。 可以特異結(jié)合底物，就是識別出我們想要檢測的東西。一抗和底物結(jié)合與否用肉眼是看不出來的。二抗：可以和一抗結(jié)合，并帶有可以被檢測出的標記(如帶熒光、放射性、化學(xué)發(fā)光或顯色基團），作用是檢測一抗。 如果一抗自己帶有可以被檢測出的標記(如帶熒光、放射性、化學(xué)發(fā)光或顯色基團），則不需要二抗。但這樣成本很高，因為一種一抗只識別一種底物。所以如今的設(shè)計一般是二抗帶上可檢測標記，再來檢測一抗。而一抗識別底物。這樣，當一抗結(jié)合到底物上，就可以通過二抗檢測出來。
四、操作步驟：
1. 包被：用0.05M PH9.6 碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg/ml。在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡稱洗滌，下同)。
2. 5%脫脂乳（SMP）或者BSA 37℃（或者RT封閉）封閉1小時。棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。
3. 加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育1小時。然后洗滌。(同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。
4. 加酶標抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小時，洗滌。
5. 加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。
6. 終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。
7. 結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測O·D值：在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔O·D值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。
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