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J558細胞，小鼠骨髓瘤細胞 簡介：
細胞名稱：J558細胞
中文名稱：小鼠骨髓瘤細胞
生長狀態(tài)：貼壁生長
來源：ATCC
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1.試劑和溶液
1）轉(zhuǎn)印緩沖液：0.025M Tris base , 0.187 M甘氨酸 , 25%甲醇
2）氨基黑溶液：0.1% 酸性黑10B
3）1×TBST：25mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 0.2 M NaCl ,0.1%Tween 20
4）封閉液：TBST配制的5%牛奶
5）抗體稀釋液：TBST配制的5%牛奶
6）顯色系統(tǒng)：ECL顯色
2.實驗步驟
1電泳：將裂解液進行SDS-PAGE電泳，80v，30分鐘，120v，90分鐘；
2轉(zhuǎn)膜：PVDF膜在甲醇中浸泡約30秒左右，濾紙浸泡在轉(zhuǎn)印緩沖液預(yù)濕，半干法轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，10v，150分鐘；
3染色：氨基黑染色5分鐘，甲醇褪去背景色，觀察條帶；
4膜活化：將PVDF膜置于甲醇活化1min，用純水洗膜2次后再用TBST洗滌3次；
5封閉：將膜條置于5%牛奶或2% BSA中，室溫混搖2h；
6一抗孵育：將待檢抗體用3%牛奶或2% BSA稀釋到合適濃度（參照抗體說明書，根據(jù)客戶預(yù)實驗結(jié)果，稀釋度上下浮動一個數(shù)量級都為正常），將膜放入對應(yīng)的已稀釋待檢樣品中，置4℃混搖孵育隔夜；
7洗滌：取出膜放在TBST中洗滌3×5min；
8二抗孵育：將膜取出放入稀釋好的HRP標記的二抗（參照二抗說明書進行稀釋）中，室溫混搖2h；
9洗滌：取出膜放在TBST中洗滌3×5min；
10ECL顯色：將膜取出放入混勻的ECL顯色液中，孵育3min，將膜取出貼在有熒光角標的膠片上，迅速用保鮮膜包好；
11曝光：把底片放在暗盒中，根據(jù)熒光強度分別對X光膠片作不同時間段的曝光，曝光結(jié)束后，將底片取出，1min顯影，30s清洗，1min定影，30s清洗，晾干；
12結(jié)果分析：用掃描儀將曝光后的X光膠片掃描，做后續(xù)結(jié)果分析。
選擇適當(dāng)?shù)募毎臃N濃度。一般情況下，96孔培養(yǎng)板的一內(nèi)貼壁細胞長滿時約有105個細胞。但由于不同細胞貼壁后面積差異很大，因此，在進行MTT試驗前，要進行預(yù)實驗檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數(shù)條件下的生長曲線，確定試驗中每孔的接種細胞數(shù)和培養(yǎng)時間，以保證培養(yǎng)終止致細胞過滿。這樣，才能保證MTT結(jié)晶形成酌量與細胞數(shù)呈的線性關(guān)系。否則細胞數(shù)太多敏感性降低，太少觀察不到差異。
注意:細胞株的生物等級，由于有些細胞株及菌株屬于管制品，所以從國外購貨比較麻煩。
形態(tài)學(xué)改變:細胞體積明顯增大,為成熟淋巴細胞3-4倍。核膜清晰,核染色質(zhì)疏松呈網(wǎng)狀。核內(nèi)見明顯核仁1-4個。胞漿豐富,嗜堿性,有偽足樣突出。胞漿內(nèi)有時可見小空泡。
細胞培養(yǎng)是一種無菌操作技術(shù)，要求工作環(huán)境和條件必須保證無微生物污染和不受其它有害因素的影響。細胞培養(yǎng)室和設(shè)計原則是防止微生物污染和有害因素影響，要求工作環(huán)境清潔、空氣清新，干燥和無煙塵。細胞培養(yǎng)室的設(shè)計原則一般是無菌操作區(qū)設(shè)在室內(nèi)較少走動的內(nèi)側(cè)，常規(guī)操作和封閉培養(yǎng)于一室，而洗刷消毒在另一室。
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