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細胞凍存主要操作步驟:
1.選擇處于對數(shù)生長期的細胞,在凍存前一天換液。將多個培養(yǎng)瓶中的細胞培養(yǎng)液去掉,用0.25% 胰蛋白酶消化。適時去掉胰蛋白酶,加入少量新培養(yǎng)液。用吸管吸取培養(yǎng)液反復吹打瓶壁上的細胞,使其成為均勻分散的細胞懸液。懸浮生產(chǎn)細胞則不要消化處理。然后將細胞收集于離心管中離心(1000r/min,10分鐘)。
2.去上清液,加入含20%小牛血清的*培養(yǎng)基,于4℃預冷15分鐘后,逐滴加入已無菌的DMSO或甘油,用吸管輕輕吹打使細胞均勻,細胞濃度為3×106~1×107/mL之間。
3.將上述細胞分裝于安瓿或冷凍塑料管中,安瓿裝1~1.5mL在火焰噴燈上封口,封口處要*封閉,圓滑無勾。冷凍管要將蓋子蓋緊,并標記好細胞名稱和凍存日期,同時作好登記(日期、細胞種類及代次、凍存支數(shù))。
4.將裝好細胞的安瓿或凍存管裝入沙布袋內(nèi);置于液氮容器頸口處存放隔夜,次日轉(zhuǎn)入液氮中。采用控制降溫速度的方法也可采用下列步驟:先將安瓿置入4℃冰箱中2~3小時,再移至冰箱冷凍室內(nèi)3~4小時(此步可省略),再吊入液氮容器頸氣態(tài)部分存放2小時,zui后沉入液氮中。
細胞凍存在液氮中可以長期保存,但為妥善起見,凍存半年后,取出一只安瓿細胞復蘇培養(yǎng),觀察生長情況,然后再繼續(xù)凍存。
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在實際操作中,凍存細胞要進行復蘇,再培養(yǎng)傳代。復蘇細胞一般采用快速融化法。以保證細胞外結(jié)晶快速融化,以避免慢速融化水分滲入細胞內(nèi),再次形成胞內(nèi)結(jié)晶損傷細胞。
在細胞復蘇操作時,應注意融化凍存細胞速度要快,可不時搖動安瓿或冷凍管,使之盡快通過zui易受損的溫度段(-5~0℃)。這樣復蘇的凍存細胞存活率高,生長及形態(tài)良好。然而,由于凍存的細胞還受其他因素的影響,有時也會有部分細胞死亡。此時,可將不貼壁、飄浮在培養(yǎng)液上(已死亡)的細胞輕輕倒掉,再補以適量的新培養(yǎng)液,也會獲得較為滿意的結(jié)果。
產(chǎn)品名稱:人肝癌細胞系
供應商:ATCC ECACC Sciencell IKA等中心
供應商鏈接:上海鶴旋路26弄20號
:王
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