INS-1細胞株復蘇失敗原因分析

產(chǎn)品名稱：INS-1細胞

中文名稱：大鼠胰島素瘤細胞

種屬：大鼠

來源：胰島素瘤；NEDH

培養(yǎng)條件：DMEM

生長狀態(tài)：貼壁

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INS-1細胞株復蘇失敗原因分析

細胞的凍存與復蘇

為了防止因污染或技術原因使長期培養(yǎng)功虧一簣，考慮到培養(yǎng)細胞因傳代而遲早會出現(xiàn)變異，有時因寄贈、交換和購買，培養(yǎng)細胞從一個實驗室轉運到另一個實驗室，*的策略是進行低溫保存。這對于維持一些特殊細胞株的遺傳特性極為重要。現(xiàn)簡要介紹深低溫保存法(－70℃~－196℃)的特點。細胞深低溫保存的基本原理是：在－70℃以下時，細胞內(nèi)的酶活性均己停止，即代謝處于*停止狀態(tài)，故可以長期保存。細胞低溫保存的關鍵，在于通過0~20℃階段的處理過程。在此溫度范圍內(nèi)，水晶呈針狀，極易招致細胞的嚴重損傷。

一、細胞的凍存：為避免污染造成的損失，zui小化連續(xù)細胞系的遺傳改變和避免有限細胞系的老化和轉化，需要凍存哺乳細胞。凍存細胞前，細胞應該特性化并檢查是否污染。

有幾種普通培養(yǎng)基用來凍存細胞。對于包含有血清的培養(yǎng)基，成分可能如下：

包含10％甘油的*培養(yǎng)基，

包含10％二甲基亞砜（DMSO）的*培養(yǎng)基，

50％ 細胞條件培養(yǎng)基和50％含有10％甘油的新鮮培養(yǎng)基，或

50％ 細胞條件培養(yǎng)基和50％含有10％二甲基亞砜的新鮮培養(yǎng)基。

對于無血清培養(yǎng)基，一些普通的培養(yǎng)基成分可能是：

50％ 細胞條件無血清培養(yǎng)基和50％包含有7.5％二甲基亞砜的新鮮的無血清培養(yǎng)基，或

包含有7.5％二甲基亞砜和10％細胞培養(yǎng)級BSA的新鮮無血清培養(yǎng)基。INS-1細胞株復蘇失敗原因分析

SW1990   人胰腺癌細胞         人     胰腺癌；男性         L15   貼壁

RPMI8226        人多發(fā)性骨髓瘤細胞     人     骨髓瘤；男性         1640         懸浮

HMrSV5   人腹膜間皮細胞     人     腹膜間皮細胞         1640         貼壁

MEG-01   人成巨核細胞白血病細胞     人     慢性髓細胞性白血病；男性         1640         懸浮

CCD-18Co         正常人結腸成纖維細胞         人     結腸；成纖維細胞；女性     EMEM      貼壁

KGN 人卵巢顆粒細胞     人     卵巢；顆粒細胞；女性         DMEM     貼壁

HCC70      人乳腺導管癌細胞         人     乳腺導管癌；女性         DMEM     貼壁

C3A  人肝母細胞癌細胞         人     肝母細胞癌；男性         IMDM      貼壁

QBC939   人膽管癌細胞         人     膽管癌     1640         貼壁

Leydig       豬睪丸間質(zhì)細胞     豬     睪丸；間質(zhì)細胞     DMEM     貼壁

BPH-1       人前列腺增生細胞         人     良性前列腺增生；男性         1640         貼壁

WML2      小鼠肺成纖維細胞         小鼠         肺；成纖維細胞     DMEM     貼壁

Hs578Bst          人正常乳腺細胞     人     乳腺細胞         1640         貼壁

HCASMC  人冠狀動脈平滑肌細胞         人     冠狀動脈平滑肌     DMEM     貼壁

HSC-3       人口腔鱗癌細胞     人     舌鱗癌；男性         EMEM      貼壁

CA9-22     人口腔上皮癌細胞         人     牙齦鱗癌；男性     DMEM     貼壁

MHCC97H        人高轉移性肝癌細胞     人     肝癌；高轉移；男性     EMEM      貼壁

SSP-25      人肝膽管癌細胞     人     肝內(nèi)膽管癌；女性         DMEM     貼壁

JeKo-1      人套細胞淋巴瘤細胞     人     套細胞淋巴瘤；女性     1640         懸浮

MCF-10A 人正常乳腺上皮細胞     人     乳腺；上皮細胞；自發(fā)永生；男性     1640         貼壁

BeWo        人胎盤絨毛癌細胞         人     妊娠性絨癌     EMEM      貼壁

MOVAS     小鼠主動脈平滑肌細胞         小鼠         主動脈平滑??；SV40轉化；C57BL/6  DMEM     貼壁

MA-104    猴胎腎細胞     猴     胚腎；自發(fā)永生     DMEM     貼壁

LAD2         人肥大細胞     人     肥大細胞         1640         懸浮

HMC-1     人肥大細胞     人     肥大細胞         IMDM      懸浮

NCI-H1299       人非小細胞肺癌細胞     人     大細胞肺癌；淋巴結轉移；男性         1640         貼壁

IPEC-J2     豬小腸上皮細胞     豬     小腸；上皮細胞；自發(fā)永生         1640         貼壁

MARC-145        猴胚胎腎上皮細胞         猴     胚腎；自發(fā)永生     DMEM     貼壁

凍存細胞的復蘇:凍存細胞較脆弱，要輕柔操作。凍存細胞要快速融化，并直接加入*生長培養(yǎng)基中。若細胞對凍存劑（DMSO或甘油）敏感，離心去除凍存培養(yǎng)基，然后加入*生長培養(yǎng)基中。

1、直接鋪板方法

取出貯存細胞，37℃水浴中快速融化。

直接用*生長培養(yǎng)基鋪板細胞。1ml凍存細胞使用10~20ml*生長培養(yǎng)基。進行活細胞計數(shù)，細胞接種應該至少在3×10⁵活細胞/ml。培養(yǎng)細胞12到24小時，更換新鮮的*生長培養(yǎng)基，去除凍存劑。

2、離心方法

取出貯存細胞，37℃水浴中快速融化。

把1到2ml凍存細胞加入到大約25ml*生長培養(yǎng)基，輕輕混勻。

以大約80x g離心2到3分鐘。

棄去上清。

在*生長培養(yǎng)基輕輕再次懸浮細胞，并且進行活細胞計數(shù)。

細胞鋪板，細胞接種應該至少為3×105活細胞/ml。

三、細胞的分化、衰老與死亡

1、細胞的分化:一個成年人全身細胞總數(shù)約1012個，可以區(qū)分為200多種不同類型的細胞：形態(tài)結構，代謝，行為，功能等各不相同。追根溯源，這么多種細胞均來自一個受精卵細胞。所以，通常把發(fā)育過程中，細胞后代在形態(tài)、結構和功能上發(fā)生差異的過程稱為細胞分化。細胞分化發(fā)生在胚胎階段，也發(fā)生在胎兒出生以后，乃至成人階段。例如，人體血細胞的產(chǎn)生和分化，這個過程在人的一生中一直持續(xù)著。

由旺盛生長不斷分裂的細胞，轉入分化，通常從細胞周期中G1期開始時一個確定的點G0點“逃逸”出細胞周期。旺盛生長分裂的細胞和各種分化了的細胞，它們的基因表達和代謝活動各不相同。

2、細胞的衰老:體外細胞培養(yǎng)實驗證明：

成纖維細胞：來自胎兒傳代50次后衰老死亡,來自成人傳代20次后衰老死亡(與具體年齡有關);來自小鼠傳代14--28次后衰老死亡,來自烏龜傳代90--125次后衰老死亡。

細胞衰老過程中會發(fā)生一系列的變化，包括：蛋白質(zhì)合成速度降低，已有蛋白質(zhì)結構變化，特異蛋白質(zhì)成份出現(xiàn)；同時，細胞核，線粒體，膜系統(tǒng)、骨架系統(tǒng)等都有結構、功能的改變。

細胞衰老原因，尚無定論，出現(xiàn)過好幾種理論與假說，其中得到較廣泛認可的是“自由基損傷假說”。

3、細胞凋亡:細胞的死亡是個體存活的正?，F(xiàn)象，常見的細胞死亡形式有3種：壞死、凋亡和細胞毒性。多細胞生物的生命活動中，因為環(huán)境因素的突然變化或病原物的入侵，導致一部分細胞死，稱為細胞的病理死亡，或細胞壞死。壞死是細胞暴露于嚴重的物理或化學刺激時導致的細胞死亡；細胞毒性是由細胞或者化學物質(zhì)引起的單純的細胞殺傷事件，不依賴于其它兩種細胞死亡機理，如殺傷T細胞的細胞毒性作用。

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