ELISA在獸藥殘留檢測中的應(yīng)用
獸藥殘留分析技術(shù)是復(fù)雜混合物中的痕量分析技術(shù)，現(xiàn)代方法通常包括樣品的前處理(提取、凈化、濃縮和衍生化)和 測定兩部分。zui初，殘留分析技術(shù)極限于化學(xué)分析法、比色法和微生物法?；瘜W(xué)分析法和比色法缺乏專一性和敏感性，而微生物法雖然普通適用于抗菌藥物的殘留測定，但不易篩選到特別敏感的菌株，方法常受到其他抗菌藥物的影響。薄層色譜(TLC)操作簡單，結(jié)果可靠，但乃需要復(fù)雜的樣品前處理，靈敏度不高。20世紀60年代后的GC 和七八十年代后的質(zhì)譜(MS)、HPLC以及GC-MS、LC-MS等聯(lián)用技術(shù)的飛速發(fā)展大大地提高了分析的靈敏度和分辨率，拓寬了殘留分析范圍。HPLC和GC等方法較之微生物法有高度的靈敏度和特異性，但設(shè)備昂貴，對實驗人員也有較高的要求，分析費時而不易推廣。同時它還需要復(fù)雜煩瑣的樣品前處理且不能同時篩選大量的樣品，這對藥物殘留的及時監(jiān)控?zé)o疑是不合適的。20世紀90年代后，免疫檢測技術(shù)飛速發(fā)展，大大推動了獸藥殘留檢測技術(shù)發(fā)展的進程，一系列免疫檢測試劑盒的生產(chǎn)與應(yīng)用加快了獸藥殘留分析的標準化。目前普遍應(yīng)用于獸藥殘留分析的是酶免疫檢測法，其研究過程一般包括人工抗原的合成、抗體的制備以及檢測方法的建立等步驟。但絕大多數(shù)藥物是小分子物質(zhì)，分子量小于1KDa，沒有免疫原性，必須把它交聯(lián)到大分子蛋白質(zhì)上制備人工抗原來獲得免疫原性。因此獸藥的免疫檢測有其自身的特點。單克隆抗體在靈敏度和交叉反應(yīng)方面都優(yōu)于多克隆抗體，且具有均一性、專一性和*性等特點，有利于標準化。
內(nèi)酰胺類
Rose等用頭孢噻呋的水解產(chǎn)物去呋喃羰基頭孢噻呋作為半抗原，將其原位交聯(lián)到載體蛋白BSA和KLH上制備了兩種人工抗原，免疫BALB/c小鼠后zui終篩選出兩株單克隆抗體，cef-68和cef-116,并以之建立了檢測頭孢噻呋的Ci-ELISA方法，cef-68和cef-116的IC50分別為32ug/kg和0.33ug/kg,，其檢測限分別為32ug/kg和0.33ug/kg。單克隆抗體對頭孢噻呋有較高的選擇性，交叉反應(yīng)的數(shù)據(jù)表明只有少數(shù)頭孢菌素與之有交叉反應(yīng)，而青霉素則與之沒有交叉反應(yīng)。
氟喹諾酮類
Holtzapple等先將載體蛋白BSA、卵清蛋白OVA用過量的乙二胺處理后碳二亞胺法合成了cOVA-Sara和cBSA-Sara兩種沙丁沙星人工抗原。以cBSA-Sara免疫BALB/c小鼠，
用cOVA-Sara作包被原篩選出了6株單克隆抗體，并以之建立了檢測沙丁沙星的Ci-ELISA方法。標準曲線的IC50范圍為7.3~48.3ug/kg,批內(nèi)相對標準偏差11.0%(n=3),批間相對標準偏差10.8%(n=3),檢測限為2 ug/kg。組織樣品在10 ug/kg 、50 ug/kg、100 ug/kg的添加水平下回收率分別為132%、78%和81%。交叉反應(yīng)數(shù)據(jù)表明單抗對沙丁沙星有很高的選擇性。
Duan等制備了環(huán)丙沙星多克隆抗體，并建立了檢測環(huán)丙沙星殘留的Ci-ELISA方法，檢測限為0.32ng/mL標準曲線0.32ng/mL~5000 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，批內(nèi)和批間相對標準偏差分別為5.81%和11.23%。環(huán)丙沙星在豬肉、雞肉及牛乳中的回收率分別為75.58%、81.2%和84.5%?？寡迮c思諾沙星的交叉反應(yīng)率為69.8%，與金霉素、慶大霉素、青霉素、新霉素、喹乙醇和磺胺等無交叉反應(yīng)。蔡勤仁等制備了恩諾沙星單克隆抗體，Ci-ELISA的zui低檢測限為0.13ng/mL。
磺胺類
李喜旺等制備了6種模擬磺胺類藥物母核結(jié)構(gòu)的人工抗原和3種多克隆抗體，并對抗體的選擇性與親和性，免疫原與靶物質(zhì)的免疫相關(guān)性和免疫反應(yīng)條件進行了探討。部分抗體對參試的9種磺胺類藥物顯示了高度的選擇性和親和性，其中7種藥物Ci-ELISA抑制曲線，檢測限低于0.01 ug/mL,并在PH=4.4~5.4的介質(zhì)中親和性zui強。Sheth等制備了多種模擬磺胺類藥物母核結(jié)構(gòu)的人工抗原和多克隆抗體，并以建立了檢測磺胺類藥物的Ci-ELISA方法。
