miRNA cDNA第--鏈合成試劑盒說明書
miRNA cDNA Kit
miRNA cDNA第--鏈合成試劑盒
目錄號：K2141
保存條件：-20℃保存。
組分說明
Cat. No. K2141
Kit Size 25 次
1mM Tris，PH8.0 1 ml
E. coli Poly(A) Polymerase(5U/μl) 15 μl
10×Poly(A) Polymerase Buffer 80 μl
10mM ATP 15 μl
25μM RT primer 90 μl
5×RT Buffer 120 μl
超純dNTPs(10mM each) 30 μl
SuperRT Reverse Transcriptase 15 μl
RNase-Free Water 1 ml
本產品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及其他用途
產品簡介
本試劑盒采用在miRNA 3’末端加多聚A尾的方法來使miRNA具有Poly(A)尾，之后再使用Oligo(dT)-Universal tag通用逆轉錄引物進行逆轉錄反應，終合成miRNA對應
的第--鏈cDNA。
miRNA cDNA第--鏈合成試劑盒包含miRNA 3’末端Poly(A)尾修飾過程及修飾后逆
轉錄過程需要的全部試劑。該試劑盒具有非常高的 Poly(A)修飾和逆轉錄效率，可以從
1 ng-2 μg的total RNA中有效獲得miRNA對應的cDNA第--鏈。并且操作簡便、快捷，
可以用于從一個反應合成的cDNA中同時檢測多種miRNA，不僅減少了誤差、節(jié)約了樣
品，同時還實現(xiàn)了檢測的高通量。
備注：本試劑盒須與miRNA熒光定量檢測試劑盒（K2142）配套使用。
自備實驗材料：1 ng-2 μg的總 RNA，或0.1 ng-1 μg的小分子RNA。
注意事項
預防RNase污染，應注意以下幾方面：
1．使用無RNase的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。
2．玻璃器皿應在使用前于180℃高溫下干烤4小時，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡
10分鐘，用水*沖洗后高壓滅菌。
3．配制溶液應使用無RNase的水。
4．操作人員戴一次性口罩和手套，實驗過程中要勤換手套。
操作步驟
A．miRNA加Poly(A)尾的過程：
1．首先根據(jù)所用RNA的量，按如下公式，用1 mM Tris（PH8.0）來稀釋10 mM ATP：
ATP稀釋系數(shù)=5000/__ng的總RNA
例：如果總RNA的起始用量為100 ng，那么ATP稀釋系數(shù)=5000/100=50。即將ATP
稀釋50倍（1 μl的10 mM ATP加49 μl的1 mM Tris，PH8.0）。
2．向冰浴中預冷的無RNase反應管中加入以下試劑至總體積25 μl。
試劑 體積 終濃度
total RNA* X μl 可達2 μg
10×Poly(A) Polymerase Buffer 2.5 μl 1×
第“1”步中稀釋好的ATP 1 μl —
E. coli Poly(A) Polymerase（5U/μl） 0.5 μl 2.5 U
RNase-Free Water up to 25 μl —
*反應中使用的total RNA必須含有小分子RNA。
此過程也可以直接使用小分子RNA（建議加入量為2-5 μl。請根據(jù)目的miRNA的豐
度來確定加入量）。
3．輕輕混勻上述反應液，短暫離心將液體收集于管底。37℃，孵育15分鐘。此過程結
束后，立刻進行第--鏈cDNA的合成，或于-20℃暫存。如需長期保存，建議存放于
-80℃。
B．修飾后的miRNA cDNA第--鏈合成的過程：
1．向冰浴中預冷的無RNase反應管中加入下表中試劑，至終體積20 μl：
試劑 體積
上述Poly(A)反應液 4 μl
超純dNTPs(10mM each) 1 μl
25μM RT primer 3 μl
5×RT Buffer 4 μl
SuperRT Reverse Transcriptase 0.5 μl
RNase-Free Water 7.5 μl
2．輕輕混勻上述反應液，短暫離心將液體收集于管底。42℃，孵育50分鐘。
3．85℃，孵育5分鐘，終止反應。合成的 cDNA反應液可以直接進行熒光定量檢測實
驗，也可以于-20℃保存?zhèn)溆谩?/span>
相關產品信息
目錄號 產品名稱
K0627 miRNA提取試劑盒
K2141 miRNA cDNA第--鏈合成試劑盒
