HiFi-MMLV一步法RT-PCR試劑盒說明書

HiFi-MMLV One Step RT-PCR Kit

HiFi-MMLV一步法RT-PCR試劑盒

目錄號(hào)：K0745

保存條件：-20℃保存。

組分說明

Cat. No.                    K0745           

Kit Size                    100

HiFi-MMLV OneStep RT- PCR EnzymeMix  50 μl

2×OneStep RT-PCR Buffer         1.4 ml

RNase-Free Water               1 ml

            本產(chǎn)品僅供科研使用，請(qǐng)勿用于臨床診斷及其他用途  

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

　　本試劑盒是專為一步法RT-PCR實(shí)驗(yàn)研制，逆轉(zhuǎn)錄和PCR在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行，

反應(yīng)過程中無需添加試劑，無需打開管蓋，在避免污染的同時(shí)提高了檢測(cè)靈敏度和實(shí)驗(yàn)

效率。本試劑盒包括逆轉(zhuǎn)錄酶、快速熱啟動(dòng)   DNA聚合酶，同時(shí)包含適用于逆轉(zhuǎn)錄和

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)緩沖液和實(shí)驗(yàn)中所必需的反應(yīng)組分。HiFi-MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶RNase H活性

缺失，減少了逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中RNA的降解。HiFi-MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶熱穩(wěn)定性強(qiáng)，可獲得高產(chǎn)

量的cDNA。PCR反應(yīng)使用的快速熱啟動(dòng)DNA聚合酶具有擴(kuò)增效率高、延伸速度快的優(yōu)

良性能。*的緩沖體系使逆轉(zhuǎn)錄酶和聚合酶同時(shí)發(fā)揮大功效。使用本試劑盒擴(kuò)增得

到的目的產(chǎn)物3′端附有一個(gè)″A″堿基，可直接用于T/A克隆。

注意事項(xiàng)

1．在操作過程中應(yīng)避免RNase污染，防止RNA降解或?qū)嶒?yàn)中的交叉污染，建議在專門

   的區(qū)域進(jìn)行RNA操作，使用專門的儀器和耗材，操作人員帶口罩和一次性手套并經(jīng)

   常更換手套。

2．實(shí)驗(yàn)盡量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，應(yīng)使用0.1％DEPC（焦碳酸二乙

   酯）水溶液在37℃處理12小時(shí)，并在120℃下高壓滅菌30分鐘后使用，或者將玻璃

   器皿在180℃下干熱滅菌60分鐘后使用。實(shí)驗(yàn)中用到的無菌水應(yīng)使用 0.1%的DEPC

   處理后進(jìn)行高壓滅菌。

3．本試劑盒中的所有試劑使用前請(qǐng)上下顛倒輕輕混勻，盡量避免起泡，并經(jīng)短暫離心

   后使用。所涉及的酶類使用后應(yīng)盡快放回-20℃，避免反復(fù)凍融。

4．本試劑盒必須使用特異性引物，引物的選擇可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)來選擇，引物設(shè)計(jì)的好

   壞直接影響到RT-PCR  反應(yīng)的結(jié)果，設(shè)計(jì)引物時(shí)需考慮GC含量，引物長度，引物

   位置，PCR產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)等因素，建議采用專業(yè)的引物設(shè)計(jì)軟件來設(shè)計(jì)。

使用方法

1．將RNA模板、引物、  OneStep RT-PCR  Buffer、OneStep  RT-PCR  EnzymeMix

   和RNase-Free  Water溶解并置于冰上備用。

2．根據(jù)以下表格配制反應(yīng)體系：

 試劑        25 μl反應(yīng)體系         終濃度

2×One Step RT-PCR Buffer     12.5 μl     1×

Forward Primer，10 µM       1 μl     0.4 μM

Reverse Primer，10 µM       1 μl         0.4 μM

HiFi-MMLV OneStep RT-PCR EnzymeMix     0.5 μl

RNA Template           X μl    10 pg –1 µg

RNase-Free water      up to 25 μl

   注意：引物濃度請(qǐng)以終濃度0.1-1.0 μM作為設(shè)定范圍的參考。擴(kuò)增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí)，可降低引物濃度，由此優(yōu)化反應(yīng)體系。

3．渦旋震蕩混勻，短暫離心，將溶液收集到管底。

4．將熱循環(huán)儀預(yù)熱到45℃，將PCR管置于熱循環(huán)儀中，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。

   反應(yīng)條件：

步驟      溫度     時(shí)間

反轉(zhuǎn)錄    45℃      30 min

PCR預(yù)變性  95℃       2 min

變性    94℃       30 s

退火   55-65℃      30 s    30-40個(gè)循環(huán)

延伸   72℃       30 s

終延伸  72℃       5 min

   注意：1）一般PCR實(shí)驗(yàn)中退火溫度比擴(kuò)增引物的熔解溫度Tm低5℃，退火時(shí)間一般為20-30秒，無法得到理想的擴(kuò)增效率時(shí)，適當(dāng)降低退火溫度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí)，提高退火溫度，由此優(yōu)化反應(yīng)條件。

   2）延伸時(shí)間根據(jù)擴(kuò)增的片段大小設(shè)定，本產(chǎn)品中包含的DNA Polymerase擴(kuò)增效率為1 kb/30s。

   3）可根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的下游應(yīng)用設(shè)定循環(huán)數(shù)。循環(huán)次數(shù)太少，擴(kuò)增量不足；循環(huán)次數(shù)多，錯(cuò)配機(jī)率會(huì)增加，非特異性背景嚴(yán)重。所以，在保證產(chǎn)物得率的前提下，應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。

5．反應(yīng)結(jié)束后取5 µl反應(yīng)產(chǎn)物，加入適量上樣緩沖液后進(jìn)行電泳檢測(cè)結(jié)果。

     相關(guān)產(chǎn)品信息

目錄號(hào)               產(chǎn)品名稱                                   產(chǎn)品特點(diǎn)

YJ0580   TRIzon總RNA提取試劑               適用范圍廣的RNA提取試劑

YJ0581 超純RNA提取試劑盒

兼具有適用范圍廣和純度高特點(diǎn)的RNA提取試劑

K0597 超純RNA提取試劑盒（含DnaseI）    靈敏度高，可識(shí)別pg級(jí)別的模板。與RNA親和力強(qiáng)，

K0741   SuperRT cDNA第--鏈合成試劑盒能夠通讀GC含量高，二級(jí)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的RNA模板。

K0744   HiFi-MMLV cDNA第--鏈合成試劑盒高效獲得cDNA產(chǎn)物

SuperQuickRT  cDNA第--鏈合成試逆轉(zhuǎn)錄（針對(duì)于熒光定量PCR試劑盒(For Real-time PCR)）

K2381                       僅需15分鐘，即可完成熒光定量PCR所需的cDNA

SuperQuickRT MasterMix  即用型逆轉(zhuǎn)錄mix，只需加入RNA和水即可反應(yīng)。僅

K2391 (for Real-Time PCR)   需15分鐘，即可完成熒光定量PCR所需的cDNA

K0688   Es Taq DNA Polymerase 兼具高擴(kuò)增效率和高保真性的PCR產(chǎn)品

K0690   Es Taq MasterMix

K0957   UltraSYBR Mixture         熒光定量PCR—SYBR Green法

K0956   UltraSYBR Mixture（With ROX）   特異性強(qiáng)、Ct值低、定量更準(zhǔn)確