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        1. 上海研謹(jǐn)生物科技有限公司

          大腸桿菌的分離鑒定與耐藥性分析

          時(shí)間:2018-7-5閱讀:2025
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          大腸桿菌的分離鑒定與耐藥性分析

          • 細(xì)菌分離純化:無(wú)菌采集肝臟劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基,伊美蘭瓊脂培養(yǎng)基中,37℃恒溫培養(yǎng)12-24h,用普通培養(yǎng)基進(jìn)行純化培養(yǎng);
          • 細(xì)菌形態(tài)特征:無(wú)菌挑去上述純化培養(yǎng)菌,革蘭氏染色鏡檢

          電鏡觀察:FQ-180菌液培養(yǎng)7h后,3000r/min離心5min,棄上清,ddH2O洗滌2次重懸,取15ul滴在Formver膜覆蓋在銅網(wǎng)上,2min后滴加磷鎢酸負(fù)染2min,待銅網(wǎng)烘干后,在投射電子顯微鏡下觀察

          • 生化試驗(yàn):將初步分離到的可疑菌落進(jìn)行吲哚試驗(yàn),MR試驗(yàn),VP試驗(yàn),淀粉E試驗(yàn),枸櫞酸鈉利用試驗(yàn),乳糖、麥芽糖、蔗糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、甘露醇發(fā)酵試驗(yàn),產(chǎn)硫化氫試驗(yàn),尿素酶試驗(yàn),觸酶試驗(yàn),運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn),三塘鐵斜面穿刺試驗(yàn)(或用ATB全自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)和ID32E腸道菌鑒定試劑條進(jìn)行生化試驗(yàn))
          • 藥敏試驗(yàn):按照美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作和結(jié)果判斷(所采用的抗生素見(jiàn)圖1)
          • 血清型鑒定:采用玻板凝集反應(yīng)對(duì)分離株進(jìn)行血清型鑒定,先用多因子血清通過(guò)玻板凝集試驗(yàn)篩選可能的血清型,然后再與大腸桿菌單因子血清各10ul在玻板上混勻,30S內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集者為陽(yáng)性反應(yīng),同時(shí)以菌液與0.5%碳酸生理鹽水混合物作對(duì)照,觀察有無(wú)自凝現(xiàn)象
          • PCR鑒定:將分離純化后的菌株按照煮沸法制備細(xì)菌DNA模板,以大腸桿菌phoA基因的特異性引物進(jìn)行PCR鑒定
          • 毒力基因與耐藥性的關(guān)系:根據(jù)藥敏試驗(yàn)的結(jié)果,針對(duì)藥敏性較為普遍的抗生素的耐藥基因情況,找出其規(guī)律,并研究獨(dú)立基因與耐藥性的關(guān)系,然后采用多重PCR方法檢測(cè)耐藥基因,如4種氨基糖苷類耐藥基因aadA1,aac2,aac4,aphA3;3種四環(huán)素類耐藥性基因tetA,tetC以及tetM的流行情況
          • 提取DNA及16s rDNA鑒定:提取細(xì)菌基因組DNA,并使用16s rRNA Bacterial Identification PCR kit的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增,后進(jìn)一步對(duì)PCR擴(kuò)增的DNA克隆、測(cè)序并開(kāi)展序列分析
          • 致病性試驗(yàn):參照A.E.Williams等方法,設(shè)置16組試驗(yàn)組,1組陰性對(duì)照,實(shí)驗(yàn)組每株菌攻毒4只小組,按0.2ul/只腹腔注射菌液濃度為1*109ef/ml,對(duì)照組4只小鼠注射等劑量的生理鹽水,觀察發(fā)病及死亡情況,無(wú)菌采集死亡小鼠肝臟、心臟進(jìn)行分離鑒定
          • 雞胚致死試驗(yàn):將待測(cè)大腸桿菌分別劃板,挑去平板上的單菌落,與LB液體培養(yǎng)基中37度搖床過(guò)夜培養(yǎng),然后離心,經(jīng)PBS洗2次,并用PBS懸液進(jìn)行倍比稀釋,取0.1ml稀釋液經(jīng)尿囊腔接種12日齡SPF雞胚大約100-300CFU/只,每組10只,同時(shí)取0.1ml稀釋液涂板,做細(xì)菌計(jì)數(shù),對(duì)照分兩組,一組直射PBS,一組不注射,計(jì)每日死亡數(shù),質(zhì)4d,計(jì)胚胎致死率
          • 病毒分離:收集病樣加入青霉素(終濃度1000U/ml)和鏈霉素(終濃度1000U/ml),于4℃作用4h以上,取0.2ul接種于9-10日齡雞胚羊膜腔,37℃培養(yǎng)72h,4℃過(guò)夜后收集羊水,每份樣品接種3枚雞胚,采集的羊水用1%雞紅細(xì)胞進(jìn)行血凝試驗(yàn),判斷病毒是否成功分離,如果標(biāo)本呈陽(yáng)性,采用血凝抑制試驗(yàn)進(jìn)一步堅(jiān)定,標(biāo)本呈陰性則繼續(xù)自傳3代

           

           

           

          豬弓形蟲(chóng)抗原 (Tox-Ag)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)
          人25羥基維生素D(25-OH-D)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)
          大腸桿菌的分離鑒定與耐藥性分析

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