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嘔吐毒素ELISA
【概要】
脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)又稱嘔吐毒素(vomitoxin)，主要是由鐮刀菌的某些產(chǎn)生的化學結(jié)構(gòu)和生物活性相似的有毒代謝產(chǎn)物——單端孢霉烯族化合物中的一種。DON 的主要產(chǎn)生菌是禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)，主要污染小麥、大麥、玉米等谷類作物，也污染糧食制品，人和動物在誤食被該毒素污染的糧谷類后可以產(chǎn)生廣泛的毒性效應(yīng)。近年來發(fā)現(xiàn)DON可能與人類食管癌、IgA腎病有關(guān)。DON屬于劇毒或中等毒物，人畜攝入了被DON污染的食物/飼料后，會導致厭食、嘔吐、腹瀉、發(fā)燒、站立不穩(wěn)、反應(yīng)遲鈍等急性中毒癥狀，嚴重時損害造血系統(tǒng)造成死亡。研究表明，DON可能對免疫系統(tǒng)有影響，有明顯胚胎毒性和一定致畸作用，可能有遺傳毒性，但無致癌、致突變作用。谷物及飼料中DON的含量有嚴格的*。我國谷物中DON 的*為1．0 mg／kg 。因此，有必要對其進行有效的監(jiān)控。HPLC或GC-MS用作檢測嘔吐毒素的方法，但是其前處理步驟繁瑣，費用昂貴。酶聯(lián)免疫檢測試劑盒則可經(jīng)濟、快速地檢測嘔吐毒素。
嘔吐毒素ELISA【適用范圍】
本試劑盒可定性、定量測定大米、小米、小麥等谷物及飼料中的嘔吐毒素。
嘔吐毒素ELISA【試驗原理】
本試劑盒采用競爭ELISA，在微孔板上預(yù)包被嘔吐毒素抗原，加入樣本/嘔吐毒素標準品溶液及辣根過氧化物酶標記的嘔吐毒素抗體。樣本或標準品溶液中的嘔吐毒素與預(yù)包被在板孔上的嘔吐毒素抗原競爭結(jié)合辣根過氧化物酶標記的嘔吐毒素抗體，未結(jié)合的酶標抗體在洗滌時被除去。再加入TMB顯色，讀取吸光值。樣本的吸光值與其所含殘留物嘔吐毒素抗原的含量成負相關(guān)。對照標準曲線，即可得出相應(yīng)殘留物嘔吐毒素的含量。
嘔吐毒素ELISA【試劑盒靈敏度】
試劑盒靈敏度：3ppb
【交叉反應(yīng)率】
結(jié)構(gòu)類似物 交叉反應(yīng)率
脫氧雪腐鐮刀菌烯醇 …………………………………………………… 100%
3-乙?；撗跹└牭毒┐? ……………………………………… 15%
15-O-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇 …………………………………… 11%
【試劑盒組成】
1. 96孔板×1塊
2. 標準液×6瓶：（2ml/瓶）
0ppb, 3ppb, 9ppb, 18ppb, 36ppb,72ppb
3. 酶標物1瓶 …………………………………………… 7ml
4. 顯色液1瓶 ……………………………………………12ml
5. 終止液1瓶 ……………………………………………10ml
6. 濃縮洗滌液 （10×）1瓶 ………………………… 50ml
7. 濃縮樣品稀釋液（20×）1瓶……………………… 40ml
【需要而未提供的設(shè)備】
----微孔板酶標儀450nm/630nm
----振蕩器
----離心機
----粉碎機
----天平：感量0.01g
----微量移液器：單道 20ul～200μl、200μl～1000μl、多道 300μl
【試劑配制】
1. 洗滌工作液：將濃縮洗滌液用去離子水按1:9體積比進行稀釋（1份濃縮洗滌液+9份去離子水）。
2. 樣品稀釋液：將濃縮樣品稀釋液用去離子水按1:19體積比進行稀釋（1份濃縮樣品提取液+19份去離子水）。
【樣本前處理步驟】
一、大米、小米、面粉等谷物及飼料Ⅰ（稀釋倍數(shù)：50）
1. 取0.1g粉碎好的樣品，加入5ml樣品稀釋液，混勻；
2. 充分振蕩10min；
3. 4000g室溫離心10min；
4. 取100μl上清液體待測。
二、大米、小米、面粉等谷物及飼料Ⅱ（稀釋倍數(shù)：50）
1. 取20g粉碎好的樣品，加入100ml水，混勻；
2. 充分振蕩10min；
3. 4000g室溫離心10min或定性濾紙過濾；
4. 取50μl上清液體，加入450μl樣品稀釋液，混勻；
5. 取100μl上清液體待測。
【檢測步驟】
一、 測定前須知：
1. 使用之前將所有試劑和所需板條回溫（20～25℃）。
2. 使用之后立即將所有試劑及剩余板條放置2～8℃，干燥環(huán)境保存有利于保持試劑穩(wěn)定性。
3. ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA操作中的要點。
4. 在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜封住微孔板。
二、操作步驟：
1. 將所需試劑及微孔板取出，放置室溫（20～25℃）30min以上，液體試劑使用前均須搖勻。
2. 取出所需數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板與干燥劑一起重新真空密封，放置于2～8℃。不可冷凍。
3. 洗滌工作液在使用前也需回溫。
4. 將樣本和標準品對應(yīng)微孔編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
5. 加標準品/樣本50μl到對應(yīng)的微孔中，加入酶標物50μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)15min。
6. 小心揭開蓋板膜，用洗滌工作液充分洗滌，300μl/孔，洗板5次，每次間隔30s，用吸水紙拍干。
7. 加入顯色液100μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)15min。
8. 加終止液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)酶標儀于450nm處讀取每孔OD值。
【結(jié)果判定】
1. 百分吸光率的計算
標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光率（%）＝ B/B0 ×100%
B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0(ppb)標準溶液的平均吸光度值
2. 標準曲線的繪制與計算
以標準品百分吸光率為縱坐標，嘔吐毒素標準品濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中嘔吐毒素實際含量。
【注意事項】
1. 室溫低于20℃或試劑及樣本沒有恢復到室溫（20～25℃）會導致所有標準的OD值偏低。
2. 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。
3. 每種試劑使用前均需搖勻。
4. 反應(yīng)終止液為2M鹽酸，避免接觸皮膚。
5. 不要使用過了有效期的試劑盒；也不要摻雜使用過了有效期的試劑盒；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
6. 儲存條件：
試劑盒保存于2～8℃，不能冷凍，將不用的微孔板重新真空密封。標準物質(zhì)和無色的顯色劑對光敏感，因此要避光保存。
7. 試劑變質(zhì)的跡象：
顯色試劑有任何顏色表明顯色劑變質(zhì)，應(yīng)當棄之。0標準的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5）時，表示試劑可能變質(zhì)。
8. 加入顯色液后，一般顯色時間為15～30min。若顏色較淺，可延長反應(yīng)時間到35min（或更長），但不得超過40min。反之，則減短反應(yīng)時間。
9. 該試劑盒*反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
【試劑盒靈敏度】
試劑盒靈敏度：3ppb
【樣品zui低檢測限】
谷物、飼料…………………………………………150ppb
【貯藏條件及保存期】
貯藏條件：保存試劑盒于2～8℃。
保存期：該產(chǎn)品有效期為12個月。