YIJI動物細胞高純高爾基體分離試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）
主要用途
YIJI動物細胞高純高爾基體分離試劑是一種旨在通過機械或化學處理、差速和等密度離心方法，從動物細胞中分離出活性完整而高度純化的高爾基細胞器組分的而經(jīng)典的技術方法。該技術經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其制備物產(chǎn)量高，活性保證，純度可達99％。適合于各種動物細胞，包括人體細胞等的高爾基體的制備?？梢员挥糜谑荏w循環(huán)、糖蛋白和脂蛋白合成，以及抗體釋放機制等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能穩(wěn)定，分離產(chǎn)量高。
技術背景
高爾基體（Golgi apparatus或Golgi bodies），又稱為高爾基復合體（Golgi complex），是一種細胞器，存在于大多數(shù)真核生物細胞中。高爾基體由扁平膜結合的高爾基堆（stacks），即小池（cisternae）組成，約有4至8層，分成3個功能區(qū)：順面、中層、反面等，進一步地構成細胞膜、分泌泡、內(nèi)涵體等。高爾基體整合各種大分子進行加工、分類和包裝，然后分門別類地送到細胞特定的部位或分泌到細胞外。高爾基體參與糖蛋白質的糖基化、碳水化合物的合成、蛋白質的分泌、膜轉化、溶酶體形成的細胞活動。高爾基體的分離是現(xiàn)代細胞生物學研究的常用手段之一：*，通過機械或化學方法破裂組織細胞；第二，通過低速差速離心去除殘渣碎屑和巨大細胞器；第三，通過高速差速離心獲得高爾基體；甚至，第四，可以通過等密度離心獲得純度更高的高爾基體。
產(chǎn)品內(nèi)容
YIJI清理液（Reagent A） 毫升
YIJI裂解液（Reagent B） 毫升
YIJI凈化液（Reagent C） 毫升
YIJI活性液（Reagent D） 微升
YIJI強化液（Reagent E） 毫升
YIJI保存液（Reagent F） 毫升
YIJI高純液（Reagent G） 毫升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存YIJI凈化液（Reagent C）和YIJI活性液（Reagent D）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月
用戶自備
HANK平衡鹽緩沖溶液（YJ12028）或PBS緩沖溶液（YJ12033）：用于清理細胞
胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（YJ12024）：用于細胞脫離
*細胞培養(yǎng)液（YJ12052）：用于中和胰蛋白酶的細胞培養(yǎng)基
15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器
1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器
6毫升超速離心管：用于超高速離心的容器
4℃臺式離心機：用于樣品制備
4℃超速離心機：用于樣品制備
DOUNCE勻漿器：用于裂解組織
試管固定支架：用于離心管固定支撐
3號針筒和18號針頭：用于收集樣品
實驗步驟
實驗開始前，將試劑盒里的YIJI凈化液（Reagent C）和YIJI活性液（Reagent D）凍融，然后移出移取xx微升YIJI活性液（Reagent D）、 xx毫升YIJI凈化液（Reagent C）到xx毫升的YIJI裂解液（Reagent B）里，混勻后，置入冰槽里，標記為YIJI裂解工作液。然后進行下列操作。
- 準備5至10瓶75cm2細胞培養(yǎng)瓶的細胞（5 X 107），直至細胞生長鋪滿整個培養(yǎng)表面
- 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個細胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去
- 重復實驗步驟2一次
- 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個細胞生長表面
- 置入37℃培養(yǎng)箱3分種
- 輕輕手擊震動培養(yǎng)瓶，使細胞脫落
- 分別加入10毫升用戶自備的*細胞培養(yǎng)液
- 移入一個15毫升錐形離心管
- 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為200g
- 小心抽去上清液
- 加入xx毫升預冷的YIJI清理液（Reagent A），混勻細胞
- 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
- 小心抽去上清液
- 加入預冷的xx毫升YIJI裂解工作液
- 渦旋震蕩5秒，充分混勻
- 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器
- 在冰槽里用勻漿幫勻化細胞（約20至40下）（注意：參見注意事項7）
- 將所有細胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
- （選擇步驟）放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g
- （選擇步驟）小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
- 放進4℃超速離心機離心20分鐘，速度為10000g
- 小心移出上清液到預冷的6毫升超速離心管——此步驟獲得后線粒體組分（post mitochondrial fraction；PMF）
- 放進4℃超速離心機離心60分鐘，速度為100000g
- 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒――此步驟獲得微粒體組分
- 即刻加入xx毫升YIJI保存液（Reagent F），充分混勻沉淀物
- 加入xx毫升YIJI高純液（Reagent G），混勻
- 放進4℃超速離心機離心2小時30分鐘，速度為365000g
- 小心取出超速離心管：可見頂端和中端處（高爾基體樣品帶）和底端處（內(nèi)質網(wǎng)樣品帶）
- 小心收集頂端和中端處高爾基體樣品帶到2毫升離心管（注意：用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純高爾基體樣品
- 加入xx至xx毫升YIJI保存液（Reagent F）
- 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為100000g
- 小心抽去上清液
- 加入xx毫升YIJI保存液（Reagent F），混勻
- 放進－70℃冰箱里保存
- 化學處理法
實驗開始前，將試劑盒里的YIJI凈化液（Reagent C）和YIJI活性液（Reagent D）凍融，然后移出移取xx微升YIJI活性液（Reagent D）、xx毫升YIJI凈化液（Reagent C）到xx毫升的YIJI裂解液（Reagent B）里，混勻后，置入冰槽里，標記為YIJI裂解工作液。然后進行下列操作。
- 準備5至10瓶75cm2細胞培養(yǎng)瓶的細胞（5 X 107），直至細胞生長鋪滿整個培養(yǎng)表面
- 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個細胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去
- 重復實驗步驟2一次
- 加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個細胞生長表面
- 置入37℃培養(yǎng)箱3分種
- 輕輕手擊震動培養(yǎng)瓶，使細胞脫落
- 分別加入10毫升用戶自備的*細胞培養(yǎng)液
- 移入一個15毫升錐形離心管
- 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為200g
- 小心抽去上清液
- 加入xx毫升預冷的YIJI清理液（Reagent A），混勻細胞
- 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
- 小心抽去上清液管
- 加入預冷的xx毫升YIJI裂解工作液
- 渦旋震蕩5秒，充分混勻
- 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
- 加入預冷的xx微升YIJI強化液（Reagent E）
- 渦旋震蕩5秒，充分混勻
- 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項8）
- 加入預冷的xx毫升YIJI裂解液（Reagent B），輕輕搖動試管混勻
- （選擇步驟）放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1000g
- （選擇步驟）小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
- 放進4℃超速離心機離心20分鐘，速度為10000g
- 小心移出上清液到預冷的6毫升超速離心管——此步驟獲得后線粒體組分（post mitochondrial fraction；PMF）
- 放進4℃超速離心機離心60分鐘，速度為100000g
- 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒――此步驟獲得微粒體組分
- 即刻加入xx毫升YIJI保存液（Reagent F），充分混勻沉淀物
- 加入xx毫升YIJI高純液（Reagent G），混勻
- 放進4℃超速離心機離心2小時30分鐘，速度為365000g
- 小心取出超速離心管：可見頂端和中端處（高爾基體樣品帶）和底端處（內(nèi)質網(wǎng)樣品帶）
- 小心收集頂端和中端處高爾基體樣品帶到2毫升離心管（注意：用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純高爾基體樣品
- 加入xx至xx毫升YIJI保存液（Reagent F）
- 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為100000g
- 小心抽去上清液
- 加入xx微升YIJI保存液（Reagent F），混勻
- 放進－70℃冰箱里保存
注意事項
- 本產(chǎn)品為10次（5 X 107細胞）操作
- 操作時，須戴手套
- 操作時，避免污染母液，尤其是YIJI裂解液（Reagent B）和YIJI保存液（Reagent F）
- 所有操作均須在4℃或以下狀態(tài)進行
- 建議使用足夠的樣品量
- 建議嚴格控制操作時間
- 通常勻化次數(shù)為20至40下（或細胞顆粒塊消失為止）達到80％的細胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的細胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細胞裂解程度：完整細胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加勻化次數(shù)
- 通常孵育5分鐘達到80％的細胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的細胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升裂解物的細胞裂解程度：完整細胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加孵育時間和渦旋震蕩次數(shù)
- 對于難以裂解的細胞，采用物理勻漿法是優(yōu)先推薦的技術處理
- 通常5 X 107細胞的高爾基體含量為15微克蛋白
11． 本產(chǎn)品所獲得的高爾基體純度達95%以上
12． 高爾基體的標志蛋白是UDP半乳糖基轉移酶（UDP-galactosyl transferase）；建議使用YIJI純化高爾基體UDP半乳糖基轉移酶活性比色法定量檢測試劑盒－YJ50414.3
質量標準
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的高爾基體維持正常活性
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶
