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本文共分為了四個(gè)部分:色譜法總論、氣相色譜法、高效液相色譜、質(zhì)譜分析法,共涉及了104個(gè)色譜分析的相關(guān)知識(shí)點(diǎn)。因文章內(nèi)容過長,將分為兩期內(nèi)容供粉絲們查閱。
色譜方法總論
色譜分析法:
色譜法是一種分離分析方法,它利用樣品中各組分與流動(dòng)相和固定相的作用力不同(吸附、分配、交換等性能上的差異),先將它們分離,后按一定順序檢測各組分及其含量的方法。
色譜法的分離原理:當(dāng)混合物隨流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱時(shí),就會(huì)與柱中固定相發(fā)生作用(溶解、吸附等),由于混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異,與固定相發(fā)生作用的大小、強(qiáng)弱不同,在同一推動(dòng)力作用下,各組分在固定相中的滯留時(shí)間不同,從而使混合物中各組分按一定順序從柱中流出。這種利用各組分在兩相中性能上的差異,使混合物中各組分分離的技術(shù),稱為色譜法。
流動(dòng)相色譜分離過程中攜帶組分向前移動(dòng)的物質(zhì)。
固定相色譜分離過程中不移動(dòng)的具有吸附活性的固體或是涂漬在載體表面的液體。
色譜法的特點(diǎn):(1)分離效率高,復(fù)雜混合物,有機(jī)同系物、異構(gòu)體。(2)靈敏度高,可以檢測出μg·g-1(10-6)級(jí)甚至ng·g-1(10-9)級(jí)的物質(zhì)量。(3)分析速度快,一般在幾分鐘或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個(gè)試樣的分析。(4)應(yīng)用范圍廣,氣相色譜:沸點(diǎn)低于400℃的各種有機(jī)或無機(jī)試樣的分析。液相色譜:高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定、生物試樣的分離分析。(5)高選擇性:對(duì)性質(zhì)極為相似的組分有很強(qiáng)的分離能力。不足之處:被分離組分的定性較為困難。
色譜分析法的分類:按兩相狀態(tài)分類,按操作形式分類,按分離原理分類。
按兩相狀態(tài)分類:氣相色譜(GasChromatography,GC);液相色譜(Liquid Chromatography,LC);超臨界流體色譜(Supercritical Fluid Chromatography,SFC)。
氣相色譜:
流動(dòng)相為氣體(稱為載氣),常用的氣相色譜流動(dòng)相有N2、H2、He等氣體;按分離柱不同可分為:填充柱色譜和毛細(xì)管柱色譜;按固定相的不同又分為:氣固色譜和氣液色譜;液相色譜:流動(dòng)相為液體(也稱為淋洗液);按固定相的不同分為:液固色譜和液液色譜;超臨界流體色譜:流動(dòng)相為超臨界流體,超臨界流體是一種介于氣體和液體之間的狀態(tài)。超臨界流體色譜法是集氣相色譜法和液相色譜法的優(yōu)勢而發(fā)展起來的一種新型的色譜分離分析技術(shù),不僅能夠分析氣相色譜不宜分析的高沸點(diǎn)、低揮發(fā)性的試樣組分,而且具有比高效液相色譜更快的分析速率和更高的柱效率。
按操作形式分類:柱色譜(Column Chromatography,CC):固定相裝在柱管內(nèi),包括:填充柱色譜和毛細(xì)管柱色譜。紙色譜(Paper Chromatography, PC)固定相為濾紙;采用適當(dāng)溶劑使樣品在濾紙上展開而進(jìn)行分離,薄層色譜(Thin Layer Chromatography, TLC)固定相壓成或涂成薄層,操作方法同紙色譜。
按分離原理分類:吸附色譜(Absorption chromatography);分配色譜(Partition Chromatography);離子交換色譜(Ion Exchange Chromatography);凝膠色譜(Gel Chromatography)。
色譜圖:組分在檢測器上產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度對(duì)時(shí)間(t)所作的圖,由于它記錄了各組分流出色譜柱的情況,所以,又叫色譜流出曲線,流出曲線的突起部分稱為色譜峰。
色譜保留值:色譜保留值是色譜定性分析的依據(jù),它體現(xiàn)了各待測組分在色譜柱上的滯留情況。在固定相中溶解性能越好,或與固定相的吸附性能越強(qiáng)的組分,在柱中的滯留時(shí)間越長,或者說,將組分帶出色譜柱所需的流動(dòng)相體積越大,所以,保留值可以用保留時(shí)間和保留體積兩套參數(shù)來描述。
色譜圖上的色譜流出曲線可以說明什么問題:根據(jù)色譜峰的數(shù)目,可判斷樣品中所含組分的最少個(gè)數(shù);根據(jù)色譜峰的保留值進(jìn)行定性分析;根據(jù)色譜峰的面積或峰高進(jìn)行定量分析;根據(jù)色譜峰的保留值和區(qū)域?qū)挾仍u(píng)價(jià)色譜柱的分離效能;根據(jù)兩峰間的距離,可評(píng)價(jià)固定相及流動(dòng)相選擇是否合適。
分配比:分配比是指,在一定溫度下,組分在兩相間分配達(dá)到平衡時(shí)的質(zhì)量比。
在色譜流出曲線上,兩峰之間的距離主要由兩組分在兩相間的分配系數(shù)還是擴(kuò)散速度決定?為什么?答:分配系數(shù)。兩峰間的距離由熱力學(xué)因素決定,兩組分在兩相中分配系數(shù)差異越大,兩峰間的距離則相差越大,越容易被分離。而擴(kuò)散速度是動(dòng)力學(xué)因素,反映在色譜流出曲線上即為色譜峰的區(qū)域?qū)挾?/span>(形狀)。
色譜理論需要解決的問題:色譜分離過程的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)問題。影響分離及柱效的因素與提高柱效的途徑,柱效與分離度的評(píng)價(jià)指標(biāo)及其關(guān)系。
16.組分保留時(shí)間為何不同?色譜峰為何變寬?組分保留時(shí)間:色譜過程的熱力學(xué)因素控制,(組分和固定液的結(jié)構(gòu)和性質(zhì))。色譜峰變寬:色譜過程的動(dòng)力學(xué)因素控制,(兩相中的運(yùn)動(dòng)阻力,擴(kuò)散作用)。塔板理論和速率理論分別從熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)的角度闡述了色譜分離效能及其影響因素。
半經(jīng)驗(yàn)理論:將色譜分離過程比擬作蒸餾過程,將連續(xù)的色譜分離過程分割成多次的平衡過程的重復(fù)(類似于蒸餾塔塔板上的平衡過程)。
塔板理論的特點(diǎn):塔板理論引入了塔板數(shù)和塔板高度作為柱效的衡量指標(biāo);不同物質(zhì)在同一色譜柱上的分配系數(shù)不同,用有效塔板數(shù)和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標(biāo)時(shí),應(yīng)指明測定物質(zhì);柱效不能表示被分離組分的實(shí)際分離效果,當(dāng)兩組分的分配系數(shù)K相同時(shí),無論該色譜柱的塔板數(shù)多大,都無法分離。
塔板理論的不足:塔板理論的基本假設(shè)不符合色譜柱的實(shí)際分離過程。塔板理論無法解釋同一色譜柱在不同的流動(dòng)相流速下柱效不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,不能說明色譜峰為什么會(huì)展寬,同時(shí)未能指出影響柱效的因素及提高柱效的途徑和方法。
速率方程(也稱范第姆特方程式):H=A+B/u+C·u,H:塔板高度;u:流動(dòng)相的平均線速度(cm/s)。A.─渦流擴(kuò)散項(xiàng):A與流動(dòng)相性質(zhì)、流動(dòng)相速率無關(guān)。要減小A值,需要從提高固定相的顆粒細(xì)度和均勻性以及填充均勻性來解決。對(duì)于空心毛細(xì)管柱,A=0。固定相顆粒越小dp↓,填充的越均勻,A↓,H↓,柱效n↑,表現(xiàn)在渦流擴(kuò)散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象減輕,色譜峰較窄。B/u—分子擴(kuò)散項(xiàng):存在著濃度差,產(chǎn)生縱向擴(kuò)散;擴(kuò)散導(dǎo)致色譜峰變寬,H↑(n↓),分離變差;分子擴(kuò)散項(xiàng)與流速有關(guān),流速↓,滯留時(shí)間↑,擴(kuò)散↑;擴(kuò)散系數(shù):Dg∝(M載氣)-1/2;M載氣↑,B值↓。C·u—傳質(zhì)阻力項(xiàng):dp↓,df↓,D ↑ ,可降低傳質(zhì)阻力。
H-u曲線與最佳流速:由于,流速對(duì)這兩項(xiàng)相反的作用,流速對(duì)柱效的總影響使得存在著一個(gè)最佳流速值,即,速率方程式中塔板高度對(duì)流速的一階導(dǎo)數(shù)有一極小值。以塔板高度H對(duì)應(yīng)流速u作圖,曲線低點(diǎn)的流速即為最佳流速。
速率理論的要點(diǎn):組分分子在柱內(nèi)運(yùn)行的多路徑與渦流擴(kuò)散、濃度梯度所造成的分子擴(kuò)散及傳質(zhì)阻力使兩相間的分配平衡不能瞬間達(dá)到等因素是造成色譜峰擴(kuò)展、柱效下降的主要原因;通過選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嗔6?、載氣種類、液膜厚度及載氣流速可提高柱效;速率理論為色譜分離和操作條件選擇提供了理論指導(dǎo)。闡明了流速和柱溫對(duì)柱效及分離的影響;各種因素相互制約,如,載氣流速增大,分子擴(kuò)散項(xiàng)的影響減小,使柱效提高,但同時(shí)傳質(zhì)阻力項(xiàng)的影響增大,又使柱效下降;柱溫升高,有利于傳質(zhì),但又加劇了分子擴(kuò)散的影響。選擇最佳條件,才能使柱效達(dá)到最高。
色譜定性方法:①與標(biāo)樣對(duì)照的方法:利用保留值定性:通過對(duì)比試樣中具有與純物質(zhì)相同保留值的色譜峰,來確定試樣中是否含有該物質(zhì)及在色譜圖中的位置。不適用于不同儀器上獲得的數(shù)據(jù)之間的對(duì)比。利用加入法定性:將純物質(zhì)加入到試樣中,觀察各組分色譜峰的相對(duì)變化。②利用文獻(xiàn)保留值定性:利用相對(duì)保留值r21定性。相對(duì)保留值r21僅與柱溫和固定相性質(zhì)有關(guān)。在色譜手冊中都列有各種物質(zhì)在不同固定相上的保留數(shù)據(jù),可以用來進(jìn)行定性鑒定。
色譜定量分析:①定量校正因子:試樣中各組分質(zhì)量與其色譜峰面積成正比,即,mi=fi’·Ai;絕對(duì)校正因子:比例系數(shù)fi;單位面積對(duì)應(yīng)的物質(zhì)量:fI ’=mi/Ai,相對(duì)校正因子fi:即,組分的絕對(duì)校正因子與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的絕對(duì)校正因子之比。②常用的幾種定量方法:(1)歸一化法:特點(diǎn)及要求:簡便、準(zhǔn)確;進(jìn)樣量的準(zhǔn)確性和操作條件的變動(dòng)對(duì)測定結(jié)果影響不大;僅適用于試樣中所有組分全出峰的情況。(2)外標(biāo)法——標(biāo)準(zhǔn)曲線法:特點(diǎn)及要求:外標(biāo)法不使用校正因子,準(zhǔn)確性較高,操作條件變化對(duì)結(jié)果準(zhǔn)確性影響較大。對(duì)進(jìn)樣量的準(zhǔn)確性控制要求較高,適用于大批量試樣的快速分析。(3)內(nèi)標(biāo)法:內(nèi)標(biāo)物要滿足以下要求:(a)試樣中不含有該物質(zhì);(b)與被測組分性質(zhì)比較接近;(c)不與試樣發(fā)生化學(xué)反應(yīng);(d)出峰位置應(yīng)位于被測組分附近,且能分離開;(e)加入量適中并與待測組分接近。內(nèi)標(biāo)法特點(diǎn):內(nèi)標(biāo)法的準(zhǔn)確性較高,操作條件和進(jìn)樣量的稍許變動(dòng)對(duì)定量結(jié)果的影響不大;每個(gè)試樣的分析,都要進(jìn)行兩次稱量,不適合大批量試樣的快速分析;若將內(nèi)標(biāo)法中的試樣取樣量和內(nèi)標(biāo)物加入量固定,則:wi=Ai/As*常數(shù)。
氣相色譜
氣相色譜法(GC):是以氣體為流動(dòng)相的色譜分析法。
氣相色譜要求樣品:氣化,不適用于大部分沸點(diǎn)高和熱不穩(wěn)定的化合物,對(duì)于腐蝕性能和反應(yīng)性能較強(qiáng)的物質(zhì)更難于分析。大約有15%~20%的有機(jī)物能用氣相色譜法進(jìn)行分析。
氣相色譜儀的組成:氣路系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、溫控系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)。
氣路系統(tǒng):包括氣源、凈化器和載氣流速控制;常用的載氣有:氫氣、氮?dú)?、氦氣?/span>
進(jìn)樣系統(tǒng):包括:進(jìn)樣裝置和氣化室,氣體進(jìn)樣器(六通閥):試樣首先充滿定量管,切入后,載氣攜帶定量管中的試樣氣體進(jìn)入分離柱;液體進(jìn)樣器:不同規(guī)格的微量注射器,填充柱色譜常用10μL;毛細(xì)管色譜常用1μL;新型儀器帶有全自動(dòng)液體進(jìn)樣器,清洗、潤沖、取樣、進(jìn)樣、換樣等過程自動(dòng)完成,一次可放置數(shù)十個(gè)試樣。
進(jìn)樣方式:分流進(jìn)樣:樣品在汽化室內(nèi)氣化,蒸氣大部分經(jīng)分流管道放空,只有極小一部分被載氣導(dǎo)入色譜柱;不分流進(jìn)樣:樣品直接注入色譜的汽化室,經(jīng)過揮發(fā)后全部引入色譜柱。
分離系統(tǒng):色譜柱:填充柱(2~6mm直徑,1~5m長),毛細(xì)管柱(0.1~0.5mm直徑,幾十米長)。
溫控系統(tǒng)的作用:溫度是色譜分離條件的重要選擇參數(shù);氣化室、色譜柱恒溫箱、檢測器三部分在色譜儀操作時(shí)均需控制溫度;氣化室:保證液體試樣瞬間氣化;檢測器:保證被分離后的組分通過時(shí)不在此冷凝;色譜柱恒溫箱:準(zhǔn)確控制分離需要的溫度。
檢測系統(tǒng):作用:將色譜分離后的各組分的量轉(zhuǎn)變成可測量的電信號(hào);指標(biāo):靈敏度、線性范圍、響應(yīng)速度、結(jié)構(gòu)、通用性,通用型——對(duì)所有物質(zhì)均有響應(yīng);專屬型——對(duì)特定物質(zhì)有高靈敏響應(yīng);檢測器類型:濃度型檢測器:熱導(dǎo)檢測器、電子捕獲檢測器;質(zhì)量型檢測器:氫火焰離子化檢測器、火焰光度檢測器。
熱導(dǎo)檢測器的主要特點(diǎn):結(jié)構(gòu)簡單,穩(wěn)定性好;對(duì)無機(jī)物和有機(jī)物都有響應(yīng),不破壞樣品;靈敏度不高。
氫火焰離子化檢測器的特點(diǎn):優(yōu)點(diǎn):(1)典型的質(zhì)量型檢測器;(2)通用型檢測器(測含C有機(jī)物);(3)氫焰檢測器具有結(jié)構(gòu)簡單、穩(wěn)定性好、靈敏度高、響應(yīng)迅速、死體積小、線性范圍寬等特點(diǎn);(4)比熱導(dǎo)檢測器的靈敏度高出近3個(gè)數(shù)量級(jí),檢測下限可達(dá)10-12g·g-1;缺點(diǎn):(1)對(duì)載氣要求高;(2)檢測時(shí)要破壞樣品,無法回收樣品;(3)不能檢測yong jiu 性氣體、水及四氯化碳等。。。
電子捕獲檢測器的特點(diǎn):對(duì)鹵素、硫、磷、氮、氧有很強(qiáng)的響應(yīng);靈敏度高,可用于痕量農(nóng)藥殘留物的分析;線性范圍較窄。
火焰光度檢測器(FPD):是一種對(duì)含硫、磷化合物具有高選擇性的檢測器。含硫、磷化合物在富氫火焰中燃燒被打成有機(jī)碎片,發(fā)出不同波長的特征光譜。
固定相:固體固定相:固體吸附劑;液體固定相:由載體和固定液組成;聚合物固定相。
固體固定相:一般為固體吸附劑,常用的有活性炭,硅膠,氧化鋁和分子篩。優(yōu)點(diǎn):吸附容量大、熱穩(wěn)定性好、價(jià)格便宜;缺點(diǎn):柱效低、吸附活性中心易中毒,使用前要進(jìn)行活化。應(yīng)用:主要用于惰性氣體、H2、O2、N2、CO、CO2和CH4等一般氣體和低沸點(diǎn)物質(zhì)。
作為載體使用的物質(zhì)應(yīng)滿足的條件:表面有微孔結(jié)構(gòu),孔徑均勻,比表面積大;化學(xué)和物理惰性,即,與樣品組分不起化學(xué)反應(yīng),無吸附作用或吸附很弱;熱穩(wěn)定性好;有一定的機(jī)械強(qiáng)度和浸潤性,不易破碎;具有一定的粒度和規(guī)則的形狀,最好是球形。
對(duì)固定液的要求:在使用溫度下是液體,具有較低的揮發(fā)性;具有良好的熱穩(wěn)定性;對(duì)要分離的各組分應(yīng)具有合適的分配系數(shù);化學(xué)穩(wěn)定性好,不與樣品組分、載氣、載體發(fā)生任何化學(xué)反應(yīng)。
固定液的分類:非極性固定液、中等極性固定液、強(qiáng)極性固定液、氫鍵型固定液。
非極性固定液:主要是一些飽和烷烴和甲基硅油,它們與待測物質(zhì)分子之間的作用力以色散力為主。組分按沸點(diǎn)由低到高順序流出,若樣品中兼有極性和非極性組分,則同沸點(diǎn)的極性組分先出峰。常用的固定液有角鯊?fù)?/span>(異三十烷)、阿皮松等。。。適用于非極性和弱極性化合物的分析。
中等極性固定液:由較大的烷基和少量的極性基團(tuán)或可以誘導(dǎo)極化的基團(tuán)組成,它們與待測物質(zhì)分子間的作用力以色散力和誘導(dǎo)力為主,組分基本上按沸點(diǎn)順序出峰,同沸點(diǎn)的非極性組分先出峰。常用的固定液有鄰苯二甲酸二壬酯、聚酯等,適用于弱極性和中等極性化合物的分析。
強(qiáng)極性固定液:含有較強(qiáng)的極性基團(tuán),它們與待測物質(zhì)分子間作用力以靜電力和誘導(dǎo)力為主,組分按極性由小到大的順序出峰。常用的固定液有氧二bing qing等,適用于極性化合物的分析。
氫鍵型固定液:是強(qiáng)極性固定液中特殊的一類,與待測物質(zhì)分子間作用力以氫鍵力為主,組分依形成氫鍵的難易程度出峰,不易形成氫鍵的組分先出峰。常用的固定液有聚乙二醇、三乙醇胺等,適用于分析含F、N、O等的化合物。
固定液的選擇:①按極性相似原則選擇:極性相似,溶解度大,分配系數(shù)大,保留時(shí)間長;②按官能團(tuán)相似選擇:酯類——酯或聚酯類固定液;醇類——聚乙二醇固定液。③按主要差別選擇:各組分間沸點(diǎn)是主要差別——非極性固定液;極性為主要差別——極性固定液。④選擇混合固定液:對(duì)于難分離的復(fù)雜樣品,可選用兩種或兩種以上固定液。
聚合物固定相:既可作為固體固定相,也可作為載體,又稱高分子多孔微球。物質(zhì)在其表面既存在吸附作用,又存在溶解作用。(1)具有較大的比表面積,表面孔徑均勻;(2)對(duì)非極性及極性物質(zhì)無有害的吸附活性,拖尾現(xiàn)象小,極性組分也能出對(duì)稱峰;(3)由于不存在液膜,無流失現(xiàn)象,熱穩(wěn)定性好;(4)機(jī)械強(qiáng)度和耐腐蝕性較好,系均勻球形,在填充柱色譜中均勻性、重現(xiàn)性好,有助于減少渦流擴(kuò)散。
載氣種類的選擇:檢測器的適應(yīng)性,載氣流速的大小。
柱溫的選擇:(1)首先應(yīng)使柱溫控制在固定液的最高使用溫度(超過該溫度固定液易流失)和低使用溫度(低于此溫度固定液以固體形式存在)范圍之內(nèi)。(2)提高柱溫,可以改善傳質(zhì)阻力,有利于提高柱效,縮短分析時(shí)間,但降低了容量因子和選擇性,不利于分離。一般的原則是:在使最難分離的組分盡可能分離的前提下,盡量采用較低的柱溫,但以保留時(shí)間適宜,峰形不拖尾為度。(3)柱溫一般選擇在接近或略低于組分平均沸點(diǎn)時(shí)的溫度。(4)組分復(fù)雜,沸程寬的試樣,采用程序升溫。
載體和固定液含量的選擇:配比:固定液在載體上的涂漬量,一般指的是固定液與擔(dān)體的百分比,填充柱的配比通常在5%~25%之間。配比越低,擔(dān)體上形成的液膜越薄,傳質(zhì)阻力越小,柱效越高,分析速度也越快。配比較低時(shí),固定相的負(fù)載量低,允許的進(jìn)樣量較小。分析工作中通常傾向于使用較低的配比。
進(jìn)樣條件的選擇:
進(jìn)樣量應(yīng)控制在柱容量允許范圍及檢測器線性檢測范圍之內(nèi),進(jìn)樣要求動(dòng)作快、時(shí)間短,汽化室一般較柱溫高30~70°C。
提高色譜分離能力的途徑:(1)塔板理論:增加柱長,減小柱徑,即增加柱子塔板數(shù);(2)速率理論:減小組分在柱中的渦流擴(kuò)散和傳質(zhì)阻力,可降低塔板高度。
毛細(xì)管色譜柱的結(jié)構(gòu)特點(diǎn):(1) 不裝填料阻力小,長度可達(dá)百米的毛細(xì)管柱,管徑0.2mm;(2)氣流單途徑通過柱子,消除了組分在柱中的渦流擴(kuò)散;(3)固定液直接涂在管壁上,總柱內(nèi)壁面積較大,涂層很薄,則氣相和液相傳質(zhì)阻力大大降低。(4)毛細(xì)管色譜柱柱效高達(dá)每米3000~4000塊理論塔板,一支長度100米的毛細(xì)管柱,總的理論塔板數(shù)可達(dá)104~106。
毛細(xì)管色譜具有以下優(yōu)點(diǎn):(1)分離效率高:比填充柱高10~100倍;(2)分析速度快:用毛細(xì)管色譜分析比用填充柱色譜速度;(3)色譜峰窄、峰形對(duì)稱,較多采用程序升溫方式;(4)靈敏度高,一般采用氫焰檢測器。(5)渦流擴(kuò)散為零。
毛細(xì)管色譜的類型:(1)涂壁毛細(xì)管柱:將固定液直接涂敷在管內(nèi)壁上。柱制作相對(duì)簡單,但柱制備的重現(xiàn)性差、壽命短。(2)多孔層毛細(xì)管柱:在管壁上涂敷一層多孔性吸附劑固體微粒,構(gòu)成毛細(xì)管氣固色譜。(3)載體涂漬毛細(xì)管柱:將非常細(xì)的擔(dān)體微粒粘接在管壁上,再涂固定液。柱效較涂壁毛細(xì)管柱高。(4)化學(xué)鍵合或交聯(lián)毛細(xì)管柱:
將固定液通過化學(xué)反應(yīng)鍵合在管壁上或交聯(lián)在一起。使柱效和柱壽命進(jìn)一步提高。
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