色譜柱可分為填充柱和開(kāi)管柱兩大類(lèi)。多為金屬或玻璃制作。有直管形、盤(pán)管形、U形管等形狀。液相色譜通常均采用填充柱。色譜柱的分離效果取決于所選擇的固定相，以及色譜柱的制備和操作條件。
關(guān)于色譜柱的疑問(wèn)小析姐搜羅了100個(gè)問(wèn)答，希望恰好有你關(guān)心的。
提示：目測(cè)100個(gè)問(wèn)題看完需要65分鐘，信息量超大，需要收藏。
1.網(wǎng)上對(duì)柱子是否可以反沖一直有爭(zhēng)論，那什么樣的柱子可以反沖，什么不可以。反沖后是正者用，還是反著用。具體到各型號(hào)柱子不僅是ODS柱，其他如，正向柱、氨基柱、離子交換柱等都有解釋。

答：一般的正相反相柱應(yīng)該都能反沖，只有兩端篩板孔徑不對(duì)稱(chēng)的柱子不能反沖，不過(guò)目前這樣的柱子已經(jīng)比較少見(jiàn)了。反沖是為了把柱頭的污染物沖洗掉，反沖后還是正著用比較好，以免柱子的兩頭都被污染，我們一直提倡的是：正向使用，反向沖洗。

2.我在做方法開(kāi)發(fā)的時(shí)候,用乙腈和水作為流動(dòng)相,在調(diào)整梯度的時(shí)候發(fā)現(xiàn)，剛開(kāi)始用60%乙腈，RT為2.5分鐘，調(diào)到40%乙腈，RT沒(méi)有變化，30%也沒(méi)有變化，一直調(diào)到20%的時(shí)候，RT突然變到了約13分鐘，請(qǐng)問(wèn)這是什么原因？我用的是離子交柱。
答：離子交換柱的保留時(shí)間主要由洗脫液的離子強(qiáng)度和pH決定，你現(xiàn)在講的比較簡(jiǎn)單，需要把你的方法說(shuō)的詳細(xì)一點(diǎn)才能做具體的分析。譬如，分析物是什么情況，其含有極性電離基團(tuán)和非極性基團(tuán)是什么性質(zhì)？離子交換柱是聚合物基質(zhì)還是硅膠基質(zhì)？水相是什么緩沖鹽？

3.對(duì)于一根常用的C18柱，拿到一根新柱的時(shí)候應(yīng)該怎樣進(jìn)行活化及維護(hù)？為什么要這樣做？
答：新柱活化，實(shí)際上是一個(gè)平衡的過(guò)程，除了用流動(dòng)相平衡外，有時(shí)候還必須用所測(cè)樣品對(duì)新柱進(jìn)行平衡，特別是測(cè)定分子量比較高的多肽，尤其重要。因?yàn)?，分子量高的物質(zhì)分子，擴(kuò)散速度慢，平衡所需時(shí)間也相應(yīng)較長(zhǎng)。具體平衡方式也很簡(jiǎn)單，多進(jìn)幾次樣品，直到峰面積和保留時(shí)間穩(wěn)定，再進(jìn)行正式進(jìn)樣測(cè)定。
如果要加快平衡時(shí)間，把前面用來(lái)平衡的進(jìn)樣樣品濃度加大，或者不等洗脫完成，連續(xù)進(jìn)樣多針。用待測(cè)物對(duì)新柱平衡，目的是：將硅膠基質(zhì)填料表面具有非特異性吸附的位點(diǎn)的吸附能力飽和掉。

4.測(cè)定多肽，一般采用什么柱子？流動(dòng)相是乙腈和水，還有微量的TFA。特別是像類(lèi)似三肽的短肽，應(yīng)該怎么選擇柱子？
答：分子量不高的多肽一般選用常規(guī)C18柱就能測(cè)定，也有用離子交換柱、水性C18柱和Hilic親水作用柱的。

5.氨基柱在進(jìn)酸性樣品時(shí)，很傷柱子，如使用一段時(shí)間后，柱效降低，峰形改變，如何恢復(fù)？
答：氨基柱測(cè)酸性樣品，應(yīng)該是用氨基柱的HILIC模式。酸的存在可能會(huì)使略帶負(fù)電荷的氨基官能團(tuán)質(zhì)子化，導(dǎo)致使用一段時(shí)間后對(duì)于某些類(lèi)的分析物保留性質(zhì)有所改變或表現(xiàn)在柱效下降。建議：用5～10倍的柱體積的含0.5～1.0％NH3的乙腈-水(50：50)溶液沖洗該柱（沖洗后當(dāng)然要再用不含堿的流動(dòng)相洗去多余氨），之后，再進(jìn)行分析這類(lèi)酸性分析物時(shí)建議在流動(dòng)相中略微添加少許氨如，0.1％。

6.色譜柱的技術(shù)都有哪些？比如，封尾等，這些技術(shù)在應(yīng)用時(shí)都體現(xiàn)在哪里？
答：色譜柱技術(shù)包括填料技術(shù)和裝柱技術(shù)，填料技術(shù)自不待言，填料的好壞對(duì)色譜柱分離性能和選擇性有決定性影響。裝柱技術(shù)也沒(méi)有想象中的這么簡(jiǎn)單，不同固定相、不同粒徑、不同柱管內(nèi)徑和長(zhǎng)度，裝柱工藝都有所不同，要裝出緊密、穩(wěn)定、均一的柱床，更多是一門(mén)藝術(shù)，需要經(jīng)驗(yàn)積累。
國(guó)內(nèi)和國(guó)外想比，我認(rèn)為色譜柱的差距在于：國(guó)內(nèi)公司以前都不會(huì)自己開(kāi)發(fā)填料，一般買(mǎi)國(guó)外現(xiàn)成填料裝柱，買(mǎi)到的填料質(zhì)量控制權(quán)不在自己手里。另外因?yàn)檠b柱歷史短，經(jīng)驗(yàn)積累少，裝柱工藝也沒(méi)有*達(dá)到國(guó)外水平。另外，對(duì)色譜柱性能很關(guān)鍵的基礎(chǔ)材料——裸硅膠，國(guó)產(chǎn)的還不過(guò)關(guān)，在純度、粒徑和孔徑的均一性方面和國(guó)外產(chǎn)品相比，差距很大。

7.色譜柱技術(shù)的差距在哪里？
答：色譜柱技術(shù)包括填料技術(shù)和裝柱技術(shù)，填料技術(shù)自不待言，填料的好壞對(duì)色譜柱分離性能和選擇性有決定性影響。裝柱技術(shù)也沒(méi)有想象中的這么簡(jiǎn)單，不同固定相、不同粒徑、不同柱管內(nèi)徑和長(zhǎng)度，裝柱工藝都有所不同，要裝出緊密、穩(wěn)定、均一的柱床，更多是一門(mén)藝術(shù)，需要經(jīng)驗(yàn)積累。
國(guó)內(nèi)和國(guó)外想比，我認(rèn)為色譜柱的差距在于：國(guó)內(nèi)公司以前都不會(huì)自己開(kāi)發(fā)填料，一般買(mǎi)國(guó)外現(xiàn)成填料裝柱，買(mǎi)到的填料質(zhì)量控制權(quán)不在自己手里。另外，因?yàn)?，裝柱歷史短，經(jīng)驗(yàn)積累少，裝柱工藝也沒(méi)有*達(dá)到國(guó)外水平。另外，對(duì)色譜柱性能很關(guān)鍵的基礎(chǔ)材料——裸硅膠，國(guó)產(chǎn)的還不過(guò)關(guān)，在純度、粒徑和孔徑的均一性方面和國(guó)外產(chǎn)品相比，差距很大。

8.柱子在什么情況下可以清洗一下篩板呢？原來(lái)也討論過(guò)這個(gè)問(wèn)題，我也拆下來(lái)清洗過(guò)，但我看到柱前段的污染更甚，于是就用刀片刮了刮，然后把清洗好的篩板安裝上去。問(wèn)題解決了，但使用壽命會(huì)不會(huì)減少呢？
答：柱頭污染了，就取出污染的，再裝一些填料。因?yàn)?，加入你刮了些填料，那么微觀的塔板數(shù)就少了。假入你刮得不多，僅表面，可能就是一些臟物，所以，問(wèn)題解決，但是，今后還會(huì)有同樣問(wèn)題，再掛，那么不小心刮，影響柱效。建議還是裝一個(gè)預(yù)柱。

9.如果柱子取下來(lái)放置一段時(shí)間，需要做什么保護(hù)嗎？
答：對(duì)一般的反相柱，也就是洗干凈后放到純甲醇（乙腈）或者是80%左右的甲醇（乙腈）水中，然后用堵頭塞緊柱兩頭，以免保存溶劑揮發(fā)，應(yīng)該不需要做特殊的保護(hù)。

10.流動(dòng)相中加入適量的si qing fu nan可以改善峰形的機(jī)理是什么？
答：《液相色譜方法及應(yīng)用》于世林編著的上面說(shuō)：甲醇為質(zhì)子給予體、乙腈為質(zhì)子接受體、si qing fu nan是偶極溶劑，應(yīng)該除了極性影響，還有另外的影響因素，至于分離機(jī)理，還是比較復(fù)雜的，不能看成是個(gè)方法。

11.關(guān)于色譜柱的填裝問(wèn)題！我個(gè)人認(rèn)為現(xiàn)在色譜柱的填裝一般有3種情況：
①?lài)?guó)外生產(chǎn)填料并填裝完成成品賣(mài)到國(guó)內(nèi)；
②國(guó)外生產(chǎn)填料，國(guó)內(nèi)填裝銷(xiāo)售；
③國(guó)內(nèi)生產(chǎn)填料，國(guó)內(nèi)填裝銷(xiāo)售。
一般情況下，第1種情況賣(mài)的zui貴，也質(zhì)量！可是我就不明白了：如果是填料的生產(chǎn)很復(fù)雜的話(huà)，那么填裝上國(guó)內(nèi)也跟不上去嗎？為什么換在國(guó)內(nèi)填裝就會(huì)出現(xiàn)或多或少的一些小問(wèn)題呢？
答：國(guó)內(nèi)填裝會(huì)出現(xiàn)質(zhì)量小問(wèn)題，和國(guó)內(nèi)目前普遍做事沒(méi)有國(guó)外嚴(yán)謹(jǐn)有關(guān)吧。如果工藝技術(shù)上沒(méi)有問(wèn)題，又能制訂并切實(shí)執(zhí)行一整套嚴(yán)格的生產(chǎn)質(zhì)量管理措施，國(guó)內(nèi)填裝和國(guó)外填裝并無(wú)區(qū)別。

12.國(guó)產(chǎn)色譜柱在市場(chǎng)上占有比例如何啊？
答：國(guó)內(nèi)色譜柱市場(chǎng)還沒(méi)有人進(jìn)行過(guò)科學(xué)統(tǒng)計(jì)，連一年色譜柱銷(xiāo)售總量也眾說(shuō)紛云，更別說(shuō)國(guó)內(nèi)生產(chǎn)色譜柱所占份額了。我估計(jì)是占30%左右吧。

13.預(yù)柱或保護(hù)柱用還是不用的問(wèn)題！原來(lái)分析中藥品種時(shí)，我一直都是用保護(hù)柱。但來(lái)到新公司后，發(fā)現(xiàn)大家都沒(méi)有使用，幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室連保護(hù)柱都沒(méi)找到一個(gè)，也就是說(shuō)大家從來(lái)都沒(méi)有用過(guò)。后來(lái)問(wèn)一個(gè)老員工，說(shuō)是有可能影響藥品分析。我就想問(wèn)：安裝保護(hù)柱后會(huì)影響樣品分析嗎？我們做的大多是頭孢類(lèi)的抗生素。
答：應(yīng)該這樣說(shuō)，加上保護(hù)柱，肯定有利于保護(hù)色譜柱不受一些顆粒物質(zhì)的堵塞，肯定有害于分離度和柱效，因?yàn)楸Ｗo(hù)柱中間有著死體積的存在但是如果保護(hù)柱接得好并且盡量控制其匹配性和經(jīng)常更換，分離度和柱效應(yīng)該影響并不大。
頭孢類(lèi)的抗生素也要看到底是原料藥還是制劑嘍，有些原料藥，可以根據(jù)色譜柱的損耗選擇添加預(yù)柱（中間是個(gè)篩板），制劑的話(huà)，如果有輔料嚴(yán)重干擾或者流動(dòng)相鹽分比較大，那還是配個(gè)保護(hù)柱。

14.用的是四元梯度泵：A：50%甲醇；B：50%水， 經(jīng)常出現(xiàn)?；蜻M(jìn)氣泡這是什么原因？
答：水/甲醇比例在55：45時(shí)，黏度和柱壓有個(gè)極大值。50：50接近了這個(gè)極值，柱壓是比較高的，但，影響柱壓zui大的還是填料粒徑和色譜柱內(nèi)徑，你這個(gè)實(shí)例中不知用的什么規(guī)格的色譜柱？系統(tǒng)壓力高，可能會(huì)因溶劑泵中的過(guò)濾頭供液速度跟不上而導(dǎo)致氣泡進(jìn)入系統(tǒng)，停機(jī)也應(yīng)該是因?yàn)闅馀葸M(jìn)入壓力下降的原因，可考慮更換液體通量更大的過(guò)濾頭。

15.填料方法的前三種都是濕法嗎，能不能對(duì)四種填充方法做一個(gè)簡(jiǎn)短的說(shuō)明？
答：
資料顯示：在正常條件下，填料粒度＞20µm時(shí)，干法填充制備柱較為合適；顆粒＜20µm時(shí)，濕法填充較為理想。填充方法一般有4種
①  高壓勻漿法，多用于分析柱和小規(guī)模制備柱的填充；
②  徑向加壓法，Waters；
③  軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱；
④干法。柱填充的技術(shù)性很強(qiáng)，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用已填充好的商品柱。為什么以20μm為分界點(diǎn)？

16.想請(qǐng)您具體說(shuō)明一下反沖色譜柱的方法，是不連檢測(cè)器嗎？
答：反沖就是將柱子反向連到系統(tǒng)中。因?yàn)?，有污染物反沖出來(lái)，當(dāng)然不連檢測(cè)器，出液端直接接到廢液瓶就可以。

17.如果不使用不銹鋼接頭，而改用peek頭，是否可以完*接頭匹配問(wèn)題？
答：色譜柱接頭其實(shí)大都不是色譜柱廠(chǎng)商自己生產(chǎn)的，供貨商有多個(gè)，VICI，Upchurch，Parker等，他們的標(biāo)準(zhǔn)相互之間不統(tǒng)一，那色譜柱接頭的標(biāo)準(zhǔn)就統(tǒng)一不起來(lái)。不過(guò)一般這個(gè)問(wèn)題也不難解決的，換個(gè)接頭就可以了，而且現(xiàn)在有了萬(wàn)用接頭，可以配所有不同類(lèi)型的柱頭，不泄露，連接死體積又很小。

18.有的廠(chǎng)商為避免堵塞，使用了較大孔徑（2～5μm）的前篩板，這種情況反沖會(huì)將填料沖出。那么，你們?cè)谑褂谜f(shuō)明書(shū)中會(huì)說(shuō)明前后篩板的孔徑嗎？
答：如果前后篩板孔徑不對(duì)稱(chēng)，廠(chǎng)商肯定也會(huì)在說(shuō)明書(shū)里特別提到的。

19.我在做多肽藥物時(shí)遇到下列問(wèn)題：
1）基線(xiàn)不穩(wěn)定波動(dòng)大，流動(dòng)相 A ：
1％TF，A：水溶液，B：1％TFA乙腈溶液檢測(cè)波長(zhǎng)210nm流速1.0mL/mL 什么原因？怎么解決？TFA有什么作用？流動(dòng)相中不加TFA見(jiàn)不到主峰，基線(xiàn)良好。
2）做完肽類(lèi)樣品時(shí)怎么沖洗C18比較好；
3）藥典上介紹測(cè)定分子量大于2000的樣品，選擇柱子填料的孔徑為30nm，30nm與10nm對(duì)結(jié)果有什么區(qū)別？
答：應(yīng)該是起“離子對(duì)”的作用吧。在做多肽類(lèi)樣品的時(shí)候，300A孔徑的填料相對(duì)100A孔徑肯定要選擇性好點(diǎn)，也就是分離度相對(duì)比較好點(diǎn)。流動(dòng)相加入TFA，在反相色譜分離多肽和蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)中，使用三fu乙酸(TFA)作為離子對(duì)試劑是常見(jiàn)的手段。流動(dòng)相中的三fu乙酸通過(guò)與疏水鍵合相和殘留的極性表面以多種模式相互作用，來(lái)改善峰形、克服峰展寬和拖尾問(wèn)題。
※三fu乙酸優(yōu)于其他離子修飾劑的原因是它容易揮發(fā)，可以方便地從制備樣品中除去。另一方面，三fu乙酸的紫外zui大吸收峰低于200nm ，對(duì)多肽在低波長(zhǎng)處的檢測(cè)干擾很小。

20.waters，Atlantis C18柱可以用較高比例的流動(dòng)相，那麼用完后應(yīng)該怎麼清洗？在什麼體系中保存比教合適？
答：反相柱都可以用下面通用的方法清洗維護(hù)：
流動(dòng)相中不含緩沖鹽：     
分析完成后，用甲醇（或乙腈）：水＝90：10反向沖洗色譜柱45min
流動(dòng)相中含有緩沖鹽：      
分析完成后，先用甲醇（或乙腈）：水＝10：90反向沖洗45min，然后再用甲醇（或乙腈）：水＝90：10反向沖洗色譜柱45min；（注意：甲醇（或乙腈）：水＝10：90容易長(zhǎng)菌，使用時(shí)間不可超過(guò)3天）；
水性柱保存體系也不特別：
短期保存在所用的流動(dòng)相中（不含緩沖鹽），中長(zhǎng)期保存在純甲醇（乙腈）或80%的甲醇（乙腈）/水中。

21.正相硅膠柱一般保存在什么溶劑里面比較合適？
答：短期和長(zhǎng)期都建議保存在正相測(cè)定所用的流動(dòng)相中，一般是正己烷和極少量的異丙醇。

22.磷酸鹽緩沖鹽滲透力強(qiáng)，為什么，是因?yàn)榕c醋酸鹽，枸椽酸鹽相比，基團(tuán)小嗎，使用磷酸鹽緩沖液與其它緩沖液相比，會(huì)使色譜柱壽命縮短多少？
答：經(jīng)常用磷酸鹽，在其它條件差不多一樣的情況下，柱子壽命肯定比不用磷酸緩沖鹽相對(duì)短一些。但用磷酸鹽也有不可取代的優(yōu)點(diǎn)吧，否則不可能現(xiàn)在大部分人還在用。
  
23.反相離子對(duì)色譜法中，離子對(duì)是如何起作用的，是離子對(duì)試劑的非極性端溶解在填料的非極性端里，解離端伸向流動(dòng)相，對(duì)含胺化合起離子交換作用，還是樣品與離子對(duì)生成緊密的結(jié)合物，離子對(duì)試劑掩藏化合物中的極性基團(tuán)，還是這種結(jié)合物是在解離與結(jié)合的動(dòng)態(tài)平衡之中？
答：首先離子對(duì)試劑的解離端和目標(biāo)離子形成離子締合物，降低其極性，這樣就能較好的在柱子上保留。再者，根據(jù)疏水效應(yīng)理論，離子對(duì)試劑的疏水端是很容易和C18鏈相互作用的，這樣更容易在柱子上保留，所以我認(rèn)為離子對(duì)試劑作用是混合保留機(jī)制，即純粹的反相保留和離子對(duì)保留機(jī)制共同作用。

24.四烷基季銨鹽（如，四丁基硫酸氫銨、四丁基溴化銨、四丁基氫氧化銨等）在水中電離后，也形成了類(lèi)似N＋H(CH2CH3)3的結(jié)構(gòu)N＋(CH2CH2CH2CH3)4，這種結(jié)構(gòu)也能有效的與Si－O－產(chǎn)生較強(qiáng)的靜電作用，此類(lèi)離子對(duì)用的比較少，但它的作用僅是掩藏Si－O－嗎，它對(duì)物質(zhì)的保留性能有何影響，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)檢測(cè)胺化物時(shí)，流動(dòng)相中加入磷酸緩沖鹽有增加物質(zhì)保留的趨勢(shì)，而加入三乙胺則會(huì)降低物質(zhì)的保留能力？
答：前面提到的四丁基氫氧化銨等離子對(duì)試劑確實(shí)不如辛磺酸鈉等極性基是陰離子的離子對(duì)試劑用得普遍，原因是酸類(lèi)極性物質(zhì)很容易通過(guò)降低pH值的方法提高在反相色譜中的保留能力，降低pH可抑制酸的電離，使酸處于中性狀態(tài)而與疏水碳鏈的作用力增強(qiáng)。而堿類(lèi)分析物則受硅膠基質(zhì)pH上限的嚴(yán)重影響（以前上限是8，后來(lái)抬到10，直到zui近雜化硅膠才將pH上限提到12左右）。
銨鹽類(lèi)離子對(duì)試劑確實(shí)有辛磺酸鈉等所不具有的屏蔽硅醇基作用，但其主要作用還是疏水端和疏水固定相結(jié)合，外露的陽(yáng)離子親水端和酸陰離子作用，從而提高其保留能力。當(dāng)然同樣還有第二種解釋機(jī)理，離子對(duì)試劑先和分析物結(jié)合，掩藏極性基，從而提高極性分析物在反相色譜中的保留能力。而且丁基比辛基疏水性差，這種情況下，認(rèn)為后面的結(jié)合機(jī)理占上風(fēng)的可能性更大。
檢測(cè)胺類(lèi)化合物，加入三乙胺預(yù)先和硅醇基結(jié)合，胺和硅醇基作用被三乙胺取代，保留下降是肯定的。

25.同一根色譜柱在分析完三聚氰胺后，再分析苯甲酸、山梨酸、糖精鈉時(shí)為什么保留時(shí)間會(huì)提前？
答：色譜柱被強(qiáng)保留物質(zhì)污染后，保留時(shí)間提前和滯后的情況都有，具體要看污染物的性質(zhì)，還要看分析物、固定相和污染物三者共同作用的情況，情況比較復(fù)雜，有時(shí)候比較難預(yù)測(cè)是提前還是滯后。不過(guò)你平時(shí)維護(hù)的時(shí)候，注意在測(cè)定后將污染物用有機(jī)溶劑反沖清洗，就可以減輕或避免這種情況的出現(xiàn)。建議每個(gè)分析方法用專(zhuān)門(mén)的色譜柱，長(zhǎng)遠(yuǎn)看，這樣更節(jié)省色譜柱的費(fèi)用。

26.HPLC柱前衍生和柱后衍生的相關(guān)問(wèn)題？1）為什么要衍生？2）衍生化的分類(lèi)？3）進(jìn)行衍生，適用的化合物有哪些？4）進(jìn)行衍生化的要求有哪些？5）柱前衍生和柱后衍生的優(yōu)缺點(diǎn)？
答：色譜技術(shù)中的化學(xué)衍生法系指在色譜過(guò)程中用特殊的化學(xué)試劑（一般稱(chēng)為衍生化試劑或標(biāo)記試劑）使樣品成分轉(zhuǎn)變相應(yīng)的衍生物之后進(jìn)行分離檢測(cè)或進(jìn)行檢測(cè)的方法。
目的為：
1.將紫外—可見(jiàn)強(qiáng)吸收功能基團(tuán)引入被檢測(cè)對(duì)象或?qū)⑵滢D(zhuǎn)變?yōu)闊晒庋苌铮蕴岣邫z測(cè)靈敏度；2.提高對(duì)分析樣品的分離和選擇性。
從是否與HPLC系統(tǒng)聯(lián)機(jī)的角度，化學(xué)衍生法分為在線(xiàn)online）與離線(xiàn)∣Offline）兩種。從發(fā)生衍生化的場(chǎng)合，分為柱前衍生法pre-columnderivatization）與柱后衍生法（post-columnderivatization）兩種。目前，在HPLC中，以離線(xiàn)的柱前衍生法（簡(jiǎn)稱(chēng)柱前衍生法）與在線(xiàn)的柱后衍生法（簡(jiǎn)稱(chēng)柱后衍生法）使用居多。

27.多個(gè)樣品不好不離的時(shí)候，請(qǐng)問(wèn)該怎么通過(guò)選擇合適的柱子來(lái)提高分離度？
答：提高分離度可從三個(gè)主要影響因素來(lái)考慮，柱效、選擇性和保留因子?？赏ㄟ^(guò)減小填料粒徑和增加柱長(zhǎng)提高柱效；選擇性和固定相選擇以及pH條件有關(guān)，通過(guò)選擇合適的色譜柱和合適的pH，可以提高選擇性；有時(shí)候適當(dāng)延長(zhǎng)出峰時(shí)間增加保留因子，也可提高分離度。

28.苯基柱，氰基柱該什么時(shí)候考慮用？
答：苯基柱用于含苯環(huán)的芳香族化合物的測(cè)定時(shí)，具有較高的選擇性。CN柱可作為一個(gè)保留能力zui弱的反相柱使用，也可作為一個(gè)活性降低的正相柱使用（保留時(shí)間比硅膠柱和氨基柱低很多）。

29.同樣類(lèi)型柱子還有長(zhǎng)度，粒徑等差異，這些該怎么去選擇？
答：長(zhǎng)度和粒徑都是用來(lái)改變柱效的，選擇原則是夠用就好。

30.我前幾天剛剛裝上一個(gè)新的C18柱，在進(jìn)樣之前我用100%的甲醇沖了半個(gè)多小時(shí)。剛才看到上面寫(xiě)的要活化什么的？不知道我只沖洗半小時(shí)就開(kāi)始用對(duì)柱子有沒(méi)有影響？對(duì)出峰什么的有沒(méi)有影響呢？
答：不是所有的測(cè)定，都需要對(duì)新柱子用所測(cè)樣品老化。但先按方法程序進(jìn)樣幾針，觀察到峰面積保留時(shí)間不再有明顯變化，再開(kāi)始正式測(cè)定，這是一個(gè)好習(xí)慣。按你現(xiàn)在的做法，如果針和第二針的峰面積、保留時(shí)間沒(méi)有變化，就繼續(xù)做沒(méi)影響吧。

31.現(xiàn)在色譜柱和儀器的接口還沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)化嗎，除了檢測(cè)池的出入管較小外，色譜柱的接口與peek頭不匹配的有哪個(gè)型號(hào)的色譜柱，以后使用的時(shí)候需要注意一點(diǎn)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)使用過(guò)金屬接頭的色譜柱再換成PEEK頭，常易漏液，這是因?yàn)榻饘兕^易使色譜柱接口變形嗎？
答：色譜柱接頭其實(shí)大都不是色譜柱廠(chǎng)商自己生產(chǎn)的，供貨商有多個(gè)，VICI，Upchurch，Parker等，他們的標(biāo)準(zhǔn)相互之間不統(tǒng)一，那色譜柱接頭的標(biāo)準(zhǔn)就統(tǒng)一不起來(lái)。不過(guò)一般這個(gè)問(wèn)題也不難解決的，換個(gè)接頭就可以了，而且現(xiàn)在有了萬(wàn)用接頭，可以配所有不同類(lèi)型的柱頭，不泄露，連接死體積又很小。

32.普通的C18柱能作為正相色譜柱使用嗎？正相色譜體系中zui常用也zui普通的是那種色譜柱。正相柱在使用過(guò)程中與反向柱相比有什么需要注意的地方？
答：普通C18柱作為正相柱使用，我還沒(méi)聽(tīng)說(shuō)過(guò)。正相色譜分離模式是指固定相的極性比流動(dòng)相的極性大，反過(guò)來(lái)，流動(dòng)相極性大就是反相。C18固定相屬于疏水性相對(duì)比較強(qiáng)的，疏水性強(qiáng)就是極性很弱，應(yīng)該找不出極性比它更弱的流動(dòng)相了。
正相體系常見(jiàn)的柱子有：硅膠柱、氨基柱、CN基柱和Diol二醇基柱，zui普通的應(yīng)該就是硅膠柱。正相柱和反相柱比，zui需要注意的是水分，正相柱對(duì)水分非常敏感，流動(dòng)相中水分含量的些微變化對(duì)保留時(shí)間影響很大，因此正相柱測(cè)定前平衡時(shí)間需要幾個(gè)小時(shí)甚至更長(zhǎng)。

33.色譜柱的柱頭類(lèi)型與不銹鋼毛細(xì)管接頭有6種連接方式（在講義里面提到），那么我們用戶(hù)一般是液相色譜儀是固定某一個(gè)廠(chǎng)家，而是根據(jù)樣品檢測(cè)需要更換不同類(lèi)型的色譜柱，那么怎么判斷我所購(gòu)買(mǎi)的色譜柱是否與不銹鋼毛細(xì)管是否匹配呢，我之前只是知道安捷倫和waters都有規(guī)定他們自己家的柱子與自己家的儀器配套是zui合適的，而其他廠(chǎng)家的色譜柱都很少提及，在不知道的情況下，我們?cè)撛趺催x擇？月旭的色譜柱柱頭類(lèi)型屬于哪一種類(lèi)型呢？
答：不銹鋼毛細(xì)管接頭有個(gè)缺點(diǎn)，用過(guò)一次后卡匝位置和距離毛細(xì)管末端的長(zhǎng)度就固定死了。如果下次用的色譜柱的柱頭接口深度和原來(lái)的不同，就容易產(chǎn)生死體積和泄漏。產(chǎn)生的死體積一般不大，如果只引起柱效的稍微下降而沒(méi)引起拖尾，這個(gè)問(wèn)題就容易被忽略。引起大家關(guān)注的是泄漏，如果用了新柱子，發(fā)現(xiàn)和毛細(xì)管的接口處有泄漏，就可以判斷是接頭的匹配問(wèn)題。的判斷方法還是：詢(xún)問(wèn)一下廠(chǎng)商色譜柱柱頭的類(lèi)型和柱頭接口的深度，然后和毛細(xì)管接頭的規(guī)格比較。
如果用peek接頭，發(fā)生問(wèn)題的情況就大大減少，因?yàn)?，peek接頭卡匝位置是不固定的。
接頭與色譜柱的匹配，并沒(méi)有在實(shí)際色譜應(yīng)用中造成很大的問(wèn)題，有很多人都沒(méi)有關(guān)注到這個(gè)問(wèn)題。一方面原因是使用peek接頭的情況很普遍，另外，如果發(fā)現(xiàn)不匹配，換個(gè)毛細(xì)管接頭還是非常方便的。

34.相對(duì)于氣相色譜，液相的優(yōu)勢(shì)在哪里？做防腐劑分析時(shí)，流動(dòng)相加入乙酸銨才可以出峰，原理是什么？
答：液相和氣相相比的優(yōu)勢(shì)有很多,我認(rèn)為主要在于應(yīng)用范圍更廣。氣相只限于容易氣化的低分子量物質(zhì)的分析測(cè)定，對(duì)象大部分是基礎(chǔ)化工原材料；而任何能溶解于某溶劑的物質(zhì)都能用液相分析，適用對(duì)象是分子量從幾十到幾萬(wàn)的廣大范圍。在制藥、化工、環(huán)保、食品和刑偵等諸多重要領(lǐng)域，液相都已成為主導(dǎo)的分析分離工具。也有兩者都能應(yīng)用的交叉情況，但液相的制樣更簡(jiǎn)單。液相色譜的出現(xiàn)克服了氣相色譜不能直接用于難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定及高分子化合物的弱點(diǎn)。

35.您提到“磷酸鹽緩沖鹽滲透力強(qiáng)，有加快硅膠溶解的副作用，它的存在會(huì)降低pH使用范圍。”，既然這樣，經(jīng)常使用，柱子壽命是否也下降的快呀？
答：經(jīng)常用磷酸鹽，在其它條件差不多一樣的情況下，柱子壽命肯定比不用磷酸緩沖鹽相對(duì)短一些，但，用磷酸鹽也有不可取代的優(yōu)點(diǎn)吧，否則不可能現(xiàn)在大部分人還在用。

36. CN柱的保存需要在低溫條件，但是，又不能太低，使固定相凍結(jié)，怎么控制這個(gè)溫度？怎么判斷固定相是否被凍結(jié)？固定相凍結(jié)后會(huì)是什么樣的現(xiàn)象？
答：所謂低溫儲(chǔ)存，就是放到陰涼處或者放到冰箱的冷藏室。儲(chǔ)存液只要不是純水，冰點(diǎn)都比較低，純甲醇的冰點(diǎn)是零下90度以下了。

37.我們測(cè)試樣品時(shí)，經(jīng)常會(huì)關(guān)心柱壓是否太高，但是在購(gòu)買(mǎi)色譜柱時(shí)，并沒(méi)有說(shuō)每一根色譜柱的大使用壓力是多少？針對(duì)這樣的情況，用戶(hù)怎么判斷柱壓是否超過(guò)該柱的極限？
答：裝柱時(shí)的壓力比使用時(shí)高很多，所以柱壓對(duì)色譜柱本身在使用時(shí)沒(méi)有極限問(wèn)題存在，倒是一般儀器有個(gè)40Mpa的上限。如果色譜分離度還能滿(mǎn)足分析方法要求，柱壓只要儀器能承受就OK吧。

38.使用緩沖液不當(dāng)，使硅膠溶解并重新形成粉末后，會(huì)出現(xiàn)什么樣的異常情況？怎么處理？
答：出現(xiàn)異常就是柱壓升高。小粉末在流動(dòng)相不斷沖洗帶動(dòng)下，后會(huì)聚集在柱子出口端，沉積在后篩板。處理方法只有拆下后篩板進(jìn)行清洗或更換，但這樣做會(huì)影響到柱床，處理后柱效會(huì)下降。
 
39.今天才知道濾膜的材質(zhì)分了這么幾種：再生纖維素、聚四氟乙烯、硝酸纖維和醋酸纖維等，之前只知道有有機(jī)系和水系之分？各種不同材質(zhì)的濾膜適合于什么樣的樣品？
答：
再生纖維素膜：具有蛋白質(zhì)吸收低，適用于水溶性樣品和有機(jī)溶劑；
聚四氟乙烯：適用于所有有機(jī)溶劑，酸和鹽；
尼龍66：適用于絕大多數(shù)有機(jī)溶劑和水溶液，可用于強(qiáng)酸，70%的乙醇，二氯甲烷，不適用與二甲基甲酰胺；
醋酸纖維：不適用有機(jī)溶劑，特別適用水基溶液。

40.我原來(lái)遇到個(gè)這樣的問(wèn)題，一直不知道原因。剛拿柱子做，色譜條件是成熟的，沒(méi)問(wèn)題，但是該條件下保留的物質(zhì)變的不被保留，比如，本來(lái)保留時(shí)間15分鐘卻怎么調(diào)比例都是2～3分鐘就出峰了，維護(hù)后，下次再使用又正常了，什么樣原因??？
答：大可能是發(fā)生相塌陷了。C18柱和高密鍵合封尾的C8柱，在高含水流動(dòng)相下會(huì)發(fā)生相塌陷，后果就是保留能力大幅下降。用有機(jī)相比例較高的流動(dòng)相沖洗后，又可恢復(fù)正常性能。

41.UPLC色譜柱可以反沖嗎？HPLC的色譜柱可以簡(jiǎn)單反沖，但是，UPLC的色譜柱.也是一樣的嗎？如果壓力偏高，該怎么辦？
答：如果兩端篩板孔徑對(duì)稱(chēng)，UPLC柱應(yīng)該也是可以反沖的。發(fā)現(xiàn)壓力偏高，當(dāng)然也可以用反沖清洗的方法維護(hù)，UPLC柱和普通色譜柱比，只是壓力高一點(diǎn)，不應(yīng)該有什么特殊吧。

42.常規(guī)LC的柱子粒度小，柱效高，現(xiàn)在有3.5μm的常規(guī)柱，不知道用3.5μm*250的壓力與4.6μm的壓力相差多少？
答：一般柱子4.6mm×250mm指的是其內(nèi)徑和長(zhǎng)度。粒徑才用μm的單位，但一般標(biāo)的是5μm，也有3.5μm的。其它條件一樣，光粒徑是3.5μm和5μm的柱壓差別，理論上3.5μm柱子的柱壓是5μm柱子的(5/3.5)平方倍數(shù)，即，2.04倍，簡(jiǎn)單說(shuō)就是2倍。

43.因?yàn)?，不知道流?dòng)相已走完，液相色譜柱空走了大概一晚上，請(qǐng)問(wèn)這種情況下柱子還能用嗎？如果可以應(yīng)該如何再生？
答：能用的！可能柱子里會(huì)有氣泡進(jìn)去，但之后，多用流動(dòng)相沖沖，看到基線(xiàn)穩(wěn)定，就沒(méi)問(wèn)題了。用色譜柱的保存液低流速長(zhǎng)時(shí)間沖洗，然后，再檢測(cè)一下柱效，看柱子是否恢復(fù)，液相設(shè)置一下低壓限，這樣就不怕流動(dòng)相走完而會(huì)損傷色譜柱。

44.在梯度洗脫的時(shí)候，如果整個(gè)時(shí)間程序越長(zhǎng)，保留時(shí)間的重現(xiàn)性越差，尤其是后出的峰重現(xiàn)性差更明顯，我猜估計(jì)是流量本身的誤差引起的，但是怎么盡量避免這種情況的出現(xiàn)，使保留時(shí)間重現(xiàn)性更好？
答：這個(gè)要控制好環(huán)境溫度和柱溫，易揮發(fā)的流動(dòng)相要適當(dāng)密封，同時(shí)，保留時(shí)間的漂移與儀器的精度也有關(guān)系。

45.我對(duì)聚苯乙烯-二乙烯苯柱很有興趣，主要是它耐高溫、耐酸堿、但有關(guān)這方面的文獻(xiàn)很少，但對(duì)于他的分離效能我一直心里沒(méi)底，我的問(wèn)題有三：
1）分離效果與ODS比較，是相當(dāng)呢，還是更勝*，或是更差？
2）我原以為它是整體住，但看過(guò)資料后發(fā)現(xiàn)也是顆粒的比如，5μ，請(qǐng)問(wèn)該類(lèi)型的柱是否符合速率理論、是不是粒徑越小分離效果會(huì)幾何級(jí)的增加？
3）問(wèn)什么沒(méi)有1.7μ的這種柱出現(xiàn)呢？
答：聚合物基質(zhì)色譜柱的優(yōu)點(diǎn)你已經(jīng)提到了，它的缺點(diǎn)有：對(duì)小分子分離的柱效相對(duì)硅膠基質(zhì)色譜柱要低，表面衍生化修飾也沒(méi)有在硅膠表面豐富，機(jī)械強(qiáng)度低耐壓性不好，還有碰到某些有機(jī)溶劑會(huì)溶脹等。。。
聚合物基質(zhì)柱當(dāng)然也符合速率理論！它柱效低主要是因?yàn)?，分析物在聚合物固定相中的傳質(zhì)速度比在硅膠表面固定相中慢很多。不過(guò)粒徑越小柱效幾何級(jí)增加的規(guī)律還是有的。1.7μm的硅膠基質(zhì)填料也是近幾年才商品化，1.7μm的聚合物基質(zhì)沒(méi)出來(lái)也正常，或許永遠(yuǎn)都不出來(lái)了，因?yàn)椋酆衔锬蛪翰?，粒徑做這么小，它根本承*這個(gè)高壓吧，但愿以后會(huì)有能抗高壓的聚合物填料研究出來(lái)。

46.我之前有了解到貴公司也有手性色譜柱，之前買(mǎi)過(guò)大賽璐的手性柱，其手性柱價(jià)格相比普通反相色譜柱，要高出很多倍，不知道是本身柱子裝填技術(shù)的難度大還是其他什么原因？它的主要技術(shù)關(guān)鍵在什么方面？
答：手性柱技術(shù)關(guān)鍵在于手性填料的開(kāi)發(fā)，大賽璐公司在手性填料的生產(chǎn)技術(shù)方面申請(qǐng)了保護(hù)，別的廠(chǎng)商不能生產(chǎn)，導(dǎo)致手性柱價(jià)格居高不下。前幾年傳說(shuō)該公司的保護(hù)期限快到了，國(guó)內(nèi)有些公司就想著仿制生產(chǎn)。后來(lái)又聽(tīng)說(shuō)還沒(méi)到期，情況不明。

47.“樣品與離子對(duì)生成緊密的結(jié)合物，離子對(duì)試劑掩藏化合物中的極性基團(tuán)”這句話(huà)是什么意思？離子對(duì)怎么樣掩蔽化合物中極性基團(tuán)？不就是通過(guò)靜電引力的作用形成離子締合物，來(lái)降低其極性的嗎？
答：離子對(duì)色譜是解決強(qiáng)極性物質(zhì)在反相色譜中保留能力不足的一個(gè)有效的途徑。有些堿性極性物質(zhì)，即使用100%水相做流動(dòng)相，且無(wú)論在色譜柱能承受的pH范圍內(nèi)怎么去調(diào)節(jié)pH，保留能力都不夠。如果需要分離的組分中全是可以離子態(tài)存在的，那還可以選擇離子交換色譜進(jìn)行分離。不然的話(huà)，就只有選擇離子對(duì)色譜方法了，盡管它有流傳的那么多副作用存在。
離子對(duì)試劑含親水基和疏水基，很像表面活性劑，所以一開(kāi)始離子對(duì)色譜也稱(chēng)為“皂色譜”。離子對(duì)作用的機(jī)理有兩種解釋?zhuān)闵厦娑家呀?jīng)提到了。到底是哪種解釋對(duì)，尚無(wú)定論，實(shí)際上也沒(méi)必要去定論，反正兩種解釋都通就可以了。主流的解釋也是你先提到的機(jī)理，下面示意圖更直觀：
我個(gè)人認(rèn)為，兩種機(jī)理都可能存在，要看離子對(duì)試劑、固定相和分析物這三者本身情況而定。如果離子對(duì)試劑的疏水端和固定相之間的結(jié)合力相對(duì)更強(qiáng)，示意圖的作用機(jī)理會(huì)占上風(fēng)。反之，離子對(duì)試劑親水端和分析物導(dǎo)致掩藏極性端的作用力更強(qiáng)，你后面提到的機(jī)理更可能?？傊?，要看你用的什么離子對(duì)試劑，是何種的分析物等具體情況不同而不同吧。

48.我們?cè)谟玫陌被鶗r(shí)，有時(shí)候峰型突然變寬，有拖尾，用一段時(shí)間就又好了，不明白是什么原因造成的，如果要再生氨基柱的時(shí)候應(yīng)該怎么做呢？是像您先前回答的問(wèn)題中提到的，用一定比例的氨水沖洗嗎？氨基柱可以直接用純水沖洗嗎？記得當(dāng)時(shí)買(mǎi)的氨基柱那個(gè)使用說(shuō)明書(shū)上說(shuō)不能用純水沖？是這樣的嗎？如果可以沖的話(huà)，一般沖多久？
答：氨基柱的硅膠孔內(nèi)的氨基濃度非常高（大約有1mol/L），在有水存在的時(shí)候，在孔內(nèi)形成一個(gè)pH=10左右甚至超過(guò)10的很強(qiáng)的堿性小環(huán)境，并會(huì)導(dǎo)致硅膠基體慢慢溶解。不過(guò)硅膠基體的溶解會(huì)生成酸性的硅醇基，又會(huì)降低孔內(nèi)的pH值，延緩硅膠基體的溶解進(jìn)程。一段時(shí)間后，兩個(gè)相反的過(guò)程會(huì)達(dá)成一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，從而穩(wěn)定下來(lái)。對(duì)你問(wèn)題提到的這個(gè)現(xiàn)象，我想到的是這個(gè)原因。
氨基柱，要看氨基柱的應(yīng)用模式，是正相還是HILIC？這兩種模式的情況是大不相同的。正相使用，一般很怕有水，但HILIC模式應(yīng)用，一般流動(dòng)相是乙腈/水，是不怕水的。不過(guò)，鍵合氨丙基基團(tuán)非常容易水解，所以一般氨基柱不適宜保存有水的溶劑中。作為正相應(yīng)用時(shí)，流動(dòng)相中要求一點(diǎn)都不能含水，但清洗柱子上的污染物質(zhì)，是可以含水的，因?yàn)?，水有?qiáng)極性，在正相色譜上洗脫能力*，當(dāng)然不*100%純水。氨基柱具體沖洗方法，正相條件按照正相硅膠柱的清洗方法，HILIC模式按C18柱的清洗方法。

49.采用國(guó)標(biāo)用C18柱測(cè)定辣椒精辣度，將辣椒精中添加吐溫系列乳化劑做成水溶辣椒精，請(qǐng)問(wèn)乳化劑對(duì)C18柱是否有影響？
答：乳化劑和離子對(duì)試劑類(lèi)似，有極性端和非極性端，肯定會(huì)對(duì)C18柱有影響。不過(guò)，如果辣椒精是極性物質(zhì)，乳化劑的存在可以提高其在C18柱上的保留能力。

50.公司按照國(guó)標(biāo)測(cè)定辣椒紅色素中su丹紅含量，標(biāo)品分離很好，峰也不錯(cuò)，但是，辣椒紅色素由于跟su丹紅性質(zhì)很相似，且顏色較深，分離效果很差，收得率很低，測(cè)定結(jié)果偏差很大。該如何處理樣品？色素是否會(huì)降低柱效？
答：色素不會(huì)降低柱效，但，辣椒紅色素主峰濃度過(guò)大，會(huì)影響與臨近雜質(zhì)峰的分離?？煽紤]稀釋樣品或試試用柱效更高的柱子。

51.通常我們?cè)诜治鎏烊凰幬锍煞值臅r(shí)候結(jié)構(gòu)復(fù)雜，無(wú)法考察組分的PKa值，哪我們?nèi)绾稳ミx擇合適的流動(dòng)相或者是拖尾該怎么改善呢？
答：如果天然產(chǎn)物中沒(méi)有易電離的極性基團(tuán)，就不需要用緩沖鹽調(diào)節(jié)pH。如果，天然產(chǎn)物中既有酸性基團(tuán)，也有堿性基團(tuán)，譬如，有pKa=6.2的羧基和pKa=9.0的氨基的兩性物質(zhì)，建議將pH用磷酸鹽緩沖鹽控制在2.4（如果是，諸如月旭的Ultimate LP-C18這樣的耐酸色譜柱，還可以調(diào)得更低）。
如果pH控制在6.2～9.0之間，兩個(gè)基團(tuán)都處于離子態(tài)，保留能力差，是不可取的。如果不清楚復(fù)雜物質(zhì)中含有什么基團(tuán)，也請(qǐng)將pH調(diào)到2.4或更低。因?yàn)閜H調(diào)低，起碼抑制了酸性基團(tuán)的電離而處于中性分子狀態(tài)，而增加酸性基團(tuán)這個(gè)部分在反相色譜中的保留能力；另外，低pH還抑制了硅醇基的活性，有利于獲取對(duì)稱(chēng)的峰形。
情況不明時(shí)候，為什么不建議調(diào)高pH呢？一方面一般色譜柱都不能承受pH=9以上的條件；即使是像月旭的X-timate系列一樣能耐12.5的柱子，調(diào)高pH和調(diào)低pH相比，還有一個(gè)硅醇基活性大的劣勢(shì)。

52.記得以前拿到C18柱，會(huì)用甲醇從小流量到大流量慢慢活化，這樣做的目的是什么呢？是先用溶劑活化嗎？然后再用樣品？還有測(cè)定短肽總是沖出來(lái)，該怎么解決呢？就是和溶劑峰出在一起，或者出在溶劑峰之前。
答：C18柱，會(huì)用甲醇從小流量到大流量慢慢活化，因?yàn)?，色譜柱到達(dá)用戶(hù)手中時(shí)，時(shí)間長(zhǎng)短不一，在存儲(chǔ)和運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中，可能存儲(chǔ)液有些揮發(fā)，低流速的甲醇可以很好的浸潤(rùn)固定相，使鍵合相很好的伸展，用溶劑平衡好系統(tǒng)后，可以采取多次進(jìn)樣或者加大進(jìn)樣量的方式以更快的獲得重現(xiàn)的色譜圖，這樣用樣品將色譜柱中的活化點(diǎn)飽和，就不會(huì)出現(xiàn)異常色譜現(xiàn)象的情況。

53.C18柱如果之前曾有些天一直保存在酸性環(huán)境中，會(huì)對(duì)柱子有什么損壞嗎？pH在2左右。
答：pH=2左右容易使鍵合在硅膠基質(zhì)上的固定相水解流失，包括：C18和封尾試劑的水解，封尾試劑相對(duì)更容易水解。不知道你保存的酸性環(huán)境是不是含有緩沖鹽，如果，不含緩沖鹽，只是短期幾天保存在酸性流動(dòng)相中，也不要過(guò)份擔(dān)心，多相當(dāng)于這幾天一直在使用這根色譜柱，因此減少幾天的使用壽命吧；有緩沖鹽就麻煩一點(diǎn)，保存期間水分揮發(fā)可能會(huì)導(dǎo)致緩沖鹽結(jié)晶在柱內(nèi)析出，對(duì)柱子損傷很大。

54.色譜柱的安裝有什么技巧嗎？只要保證不漏就行了嗎？還有所謂的死體積怎么測(cè)定呢？
答：色譜柱安裝技巧不多，只要接頭和柱頭匹配，確實(shí)擰緊不漏就可以了，但也要注意不要擰得太緊以至于損傷螺紋。所謂死體積就是*不保留的物質(zhì)出峰時(shí)從進(jìn)樣到流過(guò)色譜柱的總體積，一般用極性非常強(qiáng)的尿嘧啶的出峰來(lái)測(cè)定。死體積包括柱體積（色譜柱內(nèi)溶劑能占據(jù)的空腔體積）和柱外體積兩部分。
你從廠(chǎng)商這里買(mǎi)到色譜柱，柱體積已經(jīng)是固定了，你能盡量避免減少的是柱外體積。進(jìn)樣器內(nèi)死體積、毛細(xì)管長(zhǎng)度、毛細(xì)管和色譜柱連接緊湊與否，保護(hù)柱或在線(xiàn)濾器產(chǎn)生的死體積大小，都對(duì)這個(gè)有影響。樣品在柱內(nèi)，除擴(kuò)散外，還有和填料作用引起的組分分離；但樣品在柱外，那就只有擴(kuò)散這個(gè)使柱效下降的因素了。所以，要取得好的分離效率，柱外體積應(yīng)該是越小越好。
峰有時(shí)候前延，有時(shí)候拖尾，一般不是色譜柱的問(wèn)題，應(yīng)該是樣品和色譜柱填料的作用問(wèn)題，可以說(shuō)如果色譜柱類(lèi)型選擇沒(méi)問(wèn)題，關(guān)鍵就是色譜條件的選擇。包括進(jìn)樣量、樣品溶劑、流動(dòng)相組成（包括：添加劑）、流動(dòng)相pH以及柱溫，都對(duì)峰形有影響。另外，測(cè)定分子量較大的多肽，用樣品老化平衡色譜柱很重要，分子量越大的物質(zhì)，需要平衡時(shí)間越長(zhǎng)。如果柱子沒(méi)平衡好，峰形也可能會(huì)不正常。所以把你具體的測(cè)定條件也列一下，也便于有針對(duì)性的分析原因。

55.測(cè)定多肽樣品時(shí)，十幾肽或者二十幾肽時(shí)，有時(shí)峰前延的比較厲害，有時(shí)峰拖尾比較厲害，這是什么原因呢？是樣品的問(wèn)題還是柱子的問(wèn)題？
答：峰有時(shí)候前延，有時(shí)候拖尾，一般不是色譜柱的問(wèn)題，應(yīng)該是樣品和色譜柱填料的作用問(wèn)題，可以說(shuō)如果色譜柱類(lèi)型選擇沒(méi)問(wèn)題，關(guān)鍵就是色譜條件的選擇，包括：進(jìn)樣量、樣品溶劑、流動(dòng)相組成（包括：添加劑）、流動(dòng)相pH以及柱溫，都對(duì)峰形有影響，另外，測(cè)定分子量較大的多肽，用樣品老化平衡色譜柱很重要，分子量越大的物質(zhì)，需要平衡時(shí)間越長(zhǎng)。如果柱子沒(méi)平衡好，峰形也可能會(huì)不正常。所以把你具體的測(cè)定條件也列一下，也便于有針對(duì)性的分析原因。

56.柱子的平衡時(shí)間跟填料關(guān)系大嗎？哪種快，哪種慢？因?yàn)槲以谧鲭x子交換柱的時(shí)候平衡是相當(dāng)?shù)穆?
答：根據(jù)色譜速率理論，粒徑越小，柱效越高，而且當(dāng)粒徑小到亞2微米左右時(shí)，線(xiàn)速度的提高，其分離度就不再降低，從而，改變了許久以來(lái)人們不得不在 “速度和分離度之間取舍”的局面。

57.關(guān)于配置流動(dòng)相，有機(jī)相我們可以甲醇乙腈同時(shí)用，這個(gè)是基于什么考慮的？是不是根據(jù)甲醇乙腈選擇性不同、樣品在這個(gè)兩者的溶解度的差異以及調(diào)節(jié)洗流動(dòng)相脫能力來(lái)考慮的？
答：甲醇和乙腈同時(shí)用，可以獲得單純的甲醇或者乙腈不一樣的選擇性，而且洗脫能力也會(huì)改變，根據(jù)多元流動(dòng)相的強(qiáng)度因素Sab.....=Saψa+Sbψb=...Sa和Sb純?nèi)軇゛和b的溶劑強(qiáng)度因素；ψa、ψb分別為a和b的體積分?jǐn)?shù)，所以，在藥典中有很多體系都使用甲醇乙腈體系。

58.三乙胺磷酸鹽緩沖液作流動(dòng)相，柱壓一天比一天高，該怎么樣解決？
答：把柱子再生下，再生的方法搜一下有很多反沖對(duì)絕大部分色譜柱都是可行的，效果不錯(cuò)。

59.新出廠(chǎng)液相色譜柱，保護(hù)溶劑一般是什么？怎樣進(jìn)行平衡清洗比較好，一般要平衡多長(zhǎng)時(shí)間比較好？
答：柱子類(lèi)型不同，保存溶劑也會(huì)不一樣吧，具體要看說(shuō)明書(shū)的說(shuō)明。對(duì)于反相柱，一般用甲醇（乙腈）保存，也有用80%左右甲醇濃度的甲醇/水保存的。一般用流動(dòng)相平衡沖洗10～20個(gè)柱體積即可。（注意：柱體積不等于空柱管體積，4.6×250mm的色譜柱空柱管體積是4.15mL，而柱體積只有約2.5mL）

60.據(jù)說(shuō)液相色譜柱柱壓達(dá)到一定高度就不能使用了，請(qǐng)問(wèn)一般達(dá)到多高，用甲醇和乙腈是不是不一樣？
答：柱壓不是色譜柱不能使用的wei一因素，分離度才是重要的。柱壓只要沒(méi)高到儀器不能承受的地步，例如，超過(guò)300bar，就可以一直使用。甲醇的粘度比乙腈高，同樣狀況的柱子，如果用甲醇做流動(dòng)相，柱壓可能超了，換用乙腈會(huì)使柱壓下降不少，儀器還能承受。不過(guò)盡管柱壓還沒(méi)上升到接近400Bar的限定，如果，發(fā)現(xiàn)柱壓上升速度較快，也需要及早對(duì)柱子進(jìn)行清洗維護(hù)，從根本上排除導(dǎo)致柱壓上升的源頭。

61.柱塞板可不可拆下用超聲波清洗，會(huì)有什么不良后果？
答：不建議將柱篩板拆下清洗，因?yàn)?，拆下承壓的柱篩板會(huì)導(dǎo)致柱床發(fā)生變化，影響色譜性能。應(yīng)該對(duì)污染的色譜柱先進(jìn)行清洗維護(hù)，維護(hù)沒(méi)有效果，再把拆洗柱篩板作為后的手段。

62.一般正常使用一個(gè)C18柱能用多長(zhǎng)時(shí)間？
答：柱壽命一般不按時(shí)間計(jì)算，按持續(xù)進(jìn)樣針數(shù)比較科學(xué)。一般正常使用維護(hù)，不超過(guò)pH和溫度等范圍，C18柱能達(dá)到500～2000針進(jìn)樣的壽命，視樣品干凈程度的不同而不同。

63.超高壓快速高分離度色譜柱是不是未來(lái)液相色譜柱普及應(yīng)用的一個(gè)發(fā)展趨勢(shì)？
答：這是個(gè)大話(huà)題，今后使用，會(huì)越來(lái)越多是肯定的，但是否會(huì)替代普通壓力的液相還有爭(zhēng)議。超高壓也有使用上的不便，譬如容易堵，對(duì)設(shè)備硬件要求高等。有機(jī)會(huì)我再談?wù)劤邏阂合嗌V方面詳細(xì)的一些情況。

64.如果液相色譜譜圖基線(xiàn)漂移很大是不是柱子的問(wèn)題？波長(zhǎng)越小的越大，270nm的還不怎么能看出來(lái)，230nm的就非常厲害了，有可能是什么原因造成的？
答：有可能是你的流動(dòng)相的問(wèn)題，230可能已經(jīng)快到你流動(dòng)相的截止波長(zhǎng)了，當(dāng)然，紫外吸收強(qiáng)，基線(xiàn)漂移厲害。

65.我們有一臺(tái)waters1525色譜儀，近基線(xiàn)總是呈現(xiàn)波浪形很有規(guī)律，波長(zhǎng)越小越明顯，梯度洗脫時(shí)向上飄逸而且后一段時(shí)間呈現(xiàn)波浪形，很影響分析，我想問(wèn)一下，是不是柱子的原因，用的是C18上海安普的？
答：應(yīng)該是流動(dòng)相組成變引起吸收本底變化造成的，特別是在波長(zhǎng)小的時(shí)候，乙腈的截止波長(zhǎng)低于200nm，但甲醇和水相對(duì)比較高，在低波長(zhǎng)時(shí)，甲醇和水有一定的本底吸收。梯度進(jìn)行時(shí)，隨著不同本底的組分含量的變化，基線(xiàn)也會(huì)有相應(yīng)的波動(dòng)。
 
66.我是做農(nóng)藥殘留分析的，用的是UV2487檢測(cè)器，想問(wèn)一下，C18色譜柱用什么緩沖液比較好，我以前做三聚氰胺是用檸檬酸，辛烷磺酸鈉，也用農(nóng)藥檢測(cè)行不行？還有用HLB柱能不能去除蔬菜和水果中的雜質(zhì)？
答：C18色譜柱用用磷酸鹽，醋酸鹽就比較好啊，離子對(duì)試劑不是個(gè)好東東，你要慎用。我們做三聚氰胺用三lv乙酸。

67.液相色譜柱一般使用壽命多長(zhǎng)？不同類(lèi)型的色譜柱是否壽命也不一樣？液相色譜柱與氣相的柱子有何區(qū)別呢？
答：液相色譜柱一般使用壽命多長(zhǎng)！我有一根柱子，用了大約1年半左右，發(fā)現(xiàn)同樣濃度的樣品它的峰展寬了。說(shuō)明柱效下降。但是不影響結(jié)果。因?yàn)榉迕娣e還是接近。所以做色譜之前先做下柱子性能測(cè)試。次的圖譜要保留。 測(cè)試C18RP柱，一般用到萘作為柱子的柱效判斷。一般是18000片，對(duì)稱(chēng)性（usp）0.95～1.05間。

68.①“水相”指的是什么？純水？②我們實(shí)驗(yàn)室的CN基柱保存在40%的乙腈里面，這個(gè)有不良后果嗎？
答：水相就是純水。CN基不適合保存在中等極性的溶劑中，除了可以低溫保存在極性較大的純水中外，還有可以保存在非極性溶劑如正己烷中。40%乙腈水，屬于中等極性溶劑，短期過(guò)夜保存可能問(wèn)題不大，長(zhǎng)期保存不太好，后果就是可能會(huì)發(fā)生柱床坍塌。

69. CN基柱應(yīng)該怎樣維護(hù)才好呢？比如，做完實(shí)驗(yàn)用什么流動(dòng)相沖柱子、短期用什么溶劑保存、長(zhǎng)期用什么溶劑保存等。
答：CN可作正相柱，也可作反相柱用，除了保存溶劑有特殊要求外，其它維護(hù)辦法和一般正相和反相柱沒(méi)有多大區(qū)別。

70.月旭公司的液相色譜柱接頭是大眾的還是有自己的規(guī)格，我們是waters的分析儀，有月旭的產(chǎn)品可不可以？
答：月旭公司的色譜柱柱頭的規(guī)格是大眾的，因?yàn)槲覀円膊蛔约荷a(chǎn)柱管和柱頭，月旭的柱管柱頭供貨商也是和一些Waters、Agient和Phenomenex一樣的，也許是同一家。月旭柱頭規(guī)格標(biāo)配是Valco型，但也可以按照客戶(hù)要求提供Parker型和Waters型。
你用Waters的儀器，而開(kāi)始也用的是Waters柱子，如果是用不銹鋼接頭，匝扣的位置就固定了。如果用月旭的柱子，可以把固定匝扣位置的那段剪掉，換一個(gè)新的匝扣就可以重新固定匝扣位置。當(dāng)然，如果你已換成peek接頭，問(wèn)題就不會(huì)很大。

71.色譜柱的接頭，出口處用的是peek接頭，請(qǐng)問(wèn)都用peek接頭不行么，為什么？
答：都用peek接頭我認(rèn)為都可以的，當(dāng)然，peek接頭的質(zhì)量要過(guò)關(guān)。有人認(rèn)為peek接頭不耐壓，估計(jì)是針對(duì)品質(zhì)不好的產(chǎn)品說(shuō)的。

72.我們的液相，為了節(jié)約成本我們自己填保護(hù)柱，用廢的同型號(hào)柱子填。但填完以后做標(biāo)樣定量分析有所改變。請(qǐng)問(wèn)其原因。
答：不建議自己填保護(hù)柱柱芯，填得不好的柱芯會(huì)影響分離效果，也會(huì)影響定量分析結(jié)果。你不知道廢柱子里的填料是不是受了污染，另外你填的柱芯肯定沒(méi)有廠(chǎng)商填得好，如果影響到峰形，峰面積積分結(jié)果有所改變是可能的。

73.請(qǐng)問(wèn)怎么測(cè)柱效？（柱子填料是Sino Chrom ODS-BP 5μm，規(guī)格4.6mm×200mm）
答：測(cè)定柱效不同公司不一樣，有用甲苯，也有用萘的。一般柱子里面有檢測(cè)報(bào)告，你按照?qǐng)?bào)告里的方法做一遍就可以。

74.我用苯試了一下，峰性大大好，但是，不知道理論塔板數(shù)，不知道怎么評(píng)價(jià)，感覺(jué)不大好，對(duì)稱(chēng)性不好，有點(diǎn)前延，柱子才用了四個(gè)月，是什么原因呢？是不是塌陷了呢？有什么補(bǔ)救的辦法嗎？
答：用了四個(gè)月峰形拖尾是很正常的，需要維護(hù)清洗一下色譜柱以清除引起拖尾的柱頭污染。如果柱頭塌陷，則不好辦，從其它廢柱子里取點(diǎn)填料填補(bǔ)塌陷，可以一試，但效果不一定好。色譜柱是耗材，測(cè)定進(jìn)樣針數(shù)如果達(dá)到500以上了，也算是物有所值，物盡其用了，報(bào)廢了也不可惜。

75.流動(dòng)相里之前有酸的，做完后單純用乙腈沖洗，能把酸沖洗干凈嗎？之前，他們是這樣沖的，現(xiàn)在懷疑柱子塌陷了，會(huì)不會(huì)是長(zhǎng)時(shí)間在酸性環(huán)境中造成的呢？
答：流動(dòng)相里有酸，應(yīng)該先用純水或80：20的水/乙腈溶劑沖洗吧。如果，一直在酸性環(huán)境，固定相容易流失，造成保留時(shí)間前移和其它色譜性能下降。

76.我前一段時(shí)間做三聚氰胺用C18色譜響應(yīng)值很小，幾乎無(wú)法檢測(cè)，可是檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)就是用的C18，后來(lái)我用RP18結(jié)果響應(yīng)值很好，不知道什么原因，請(qǐng)問(wèn)這兩個(gè)柱子不都是反相色譜柱么？他倆之間有什么不同？
答：RP18就是C18吧，不過(guò)C18柱之間也有區(qū)別，測(cè)定三聚氰胺一般要用極性比較大的水性C18柱。

77.磺化交聯(lián)的苯乙烯-二乙烯基共聚物為填充劑的色譜柱在儲(chǔ)存過(guò)程未注意放在冰箱中，導(dǎo)致發(fā)霉后，柱效急劇下降，能何種方法將此色譜柱修復(fù)好？
答：聚合物柱子因?yàn)椴慌滤釅A，就直接用強(qiáng)酸強(qiáng)堿清洗。如果是H型，用1M硫酸沖洗；如果是Ca型，可以先用1M硫酸沖洗，再用EDTA鈣鹽轉(zhuǎn)換回Ca型柱；如果是中性的聚合物反相柱，直接用1M的NaOH沖洗。

78.我有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的穩(wěn)定性檢測(cè)分析方法它是建立在某一供應(yīng)商的碳18柱上我知道有另一個(gè)廠(chǎng)家生產(chǎn)同樣的碳18柱但價(jià)錢(qián)是它的一半如果我更換柱子會(huì)不會(huì)影響到分析方法。。。
答：要看這一分析方法的具體要求。如果方法中有說(shuō)明“使用某一色譜柱或與其同樣的柱子，”那么，就可以使用別的柱子來(lái)替換。但要注意，不能光看一個(gè)柱子標(biāo)為碳18柱，或是其宣傳等價(jià)于某某柱，就認(rèn)為該柱適用于所有方法。必須要驗(yàn)證色譜柱的等價(jià)性。
我們需要考查使用新柱子時(shí)，系統(tǒng)適應(yīng)性是否可以通過(guò)驗(yàn)證。如果可以獲得系統(tǒng)適用性測(cè)試中所要求的保留值，分離度以及其它參數(shù)等，就可以使用該柱。推薦使用系統(tǒng)適用性測(cè)試樣品以及其它的典型樣品來(lái)進(jìn)行考查，以保證雜質(zhì)和降解物在正確的保留時(shí)間出峰并給出正確的濃度響應(yīng)；并且在新柱子上獲得的分析結(jié)果要等價(jià)于在原柱子上的結(jié)果。

79.請(qǐng)問(wèn)我做一種藥的分析查美國(guó)藥典規(guī)定使用100mm×40mm，8μm的色譜柱流速3mL/min可現(xiàn)在市場(chǎng)上已不容易找到這種規(guī)格的產(chǎn)品于是我按USP中色譜柱比較的數(shù)據(jù)庫(kù)的指引選了一款選擇性一致的等價(jià)色譜柱其規(guī)格是100mm×46mm，3μm的色譜柱當(dāng)選用3mL/min的流速時(shí)發(fā)現(xiàn)柱壓超高請(qǐng)問(wèn)我如何對(duì)方法進(jìn)行調(diào)整以滿(mǎn)足USP的要求？
答：流速調(diào)整原則是流動(dòng)相通過(guò)柱子的線(xiàn)速度一致，等價(jià)柱的截面積大了，流速也應(yīng)增加才能保持相同的線(xiàn)速度。新流速計(jì)算結(jié)果是：（4.6/4.0）2×3.0=4.0mL/min。但3mL/min流速都已導(dǎo)致柱壓太高，4.0mL/min明顯不行。好在USP還有個(gè)允許±50%的流速調(diào)整指導(dǎo)原則，這樣將流速調(diào)至2.0mL/min既符合USP規(guī)定，又能使柱壓降到可接受的范圍，但這種改變不能引起其它不好后果。
這個(gè)例子中，等度分析中，流速改變會(huì)引起塔板數(shù)和峰寬的改變，但不會(huì)影響峰的選擇性。3μm粒徑色譜柱柱效比8μm的高很多，可考慮縮短柱長(zhǎng)以補(bǔ)償或部分補(bǔ)償流速降低造成的測(cè)定時(shí)間增加。所以，更佳選擇是50mm×4.6mm，3μm的柱子，2.0ml/min的流速運(yùn)行，可以在符合USP規(guī)定的情況下，又得到更快速的測(cè)定分離。

80.近我非常的沮喪，按照藥典上的色譜條件和方法做某藥物的分析，卻始終得不到滿(mǎn)意的結(jié)果。有人建議我對(duì)色譜條件，如進(jìn)樣量、流動(dòng)相pH和溫度等，進(jìn)行微調(diào)以得到良好的峰形和分離效果，可按公司規(guī)定我不能這樣做，怎么辦？
答：如果你心里老有這個(gè)思維定勢(shì)“按規(guī)定，我不能......”，然后什么也不敢做，那真是不好辦！只有去做了，去試著改變條件看看得到什么結(jié)果，你才能發(fā)現(xiàn)問(wèn)題所在。如果改變條件后，仍得不到好結(jié)果，就要去找色譜條件以外的原因，如，色譜柱、色譜儀器以及樣品和制樣過(guò)程中的是否存在問(wèn)題？不管通過(guò)微調(diào)你是否取得了好結(jié)果，你也有了向領(lǐng)導(dǎo)匯報(bào)問(wèn)題和解決方案的依據(jù)。
而且，不能調(diào)整藥典規(guī)定色譜條件的說(shuō)法通常是不對(duì)的。美國(guó)藥典USP說(shuō)的是如果改變藥典方法需要重新做方法驗(yàn)證，但方法調(diào)整或者稱(chēng)微調(diào)以符合系統(tǒng)適應(yīng)性的要求是允許的，是不需要重新做方法驗(yàn)證的。USP列了調(diào)整的幾條指導(dǎo)原則，如，±50%的流速調(diào)整，±10°C的溫度調(diào)節(jié)等等（詳見(jiàn)"Chapter621，Chromatography，”，UnitedStates Pharmacopeia No.31-NF 26，(2008).）。當(dāng)然既然是指導(dǎo)原則，這些規(guī)定都不是的，如溫度調(diào)整±10°C，對(duì)有些方法適用，對(duì)另外的方法則±5°C的調(diào)整都會(huì)有問(wèn)題，我們應(yīng)該依據(jù)具體情況作出明智的科學(xué)判斷。

81.請(qǐng)問(wèn)下HibarRT250-4這個(gè)柱子很特殊么？為什么很多藥典中的藥物分離都用它做柱子，因?yàn)椴砰_(kāi)始做藥，不知道hi，bar的柱子特點(diǎn)是什么？
答：HibarRT250-4是Merk的一個(gè)品牌，不是很了解。大概是共用柱頭，可更換的柱管。

82.在堿性條件下硅膠溶解，又生成硅羥基的機(jī)理是什么？反應(yīng)方程式如何寫(xiě)？
答：二氧化硅溶解的反應(yīng)式是：
SiO2+2OH-=Si032-+H2O或者表示成水解的形式：SiO2+H2O=Si032-+2H+
這說(shuō)明硅膠會(huì)在堿性條件下溶解而生成硅酸根，但，我們這里說(shuō)的是硅膠顆粒表面的部分溶解，含有鍵合固定相的硅膠原表面溶解脫落后，自然會(huì)生成新鮮的硅膠表面，而新鮮的硅膠表面結(jié)構(gòu)一般都是含有硅羥基的。硅膠基本結(jié)構(gòu)單元是Si-O-Si鍵，在OH-離子的作用下，Si-O鍵斷裂，在表面形成Si-O-H硅羥基的結(jié)構(gòu)單元。
必須指出的是，在氨基柱的孔內(nèi)，并沒(méi)有單獨(dú)加入OH-離子，偏堿小環(huán)境的形成是由于氨基易和水電離生成的氫陽(yáng)離子結(jié)合造成的游離OH-離子的過(guò)剩。從個(gè)方程式角度解釋?zhuān)坞x的OH-離子用完，硅膠就不再繼續(xù)溶解；從第二個(gè)水解形式方程式角度解釋?zhuān)寒?dāng)硅膠水解生成的H+離子足夠用來(lái)和氨基結(jié)合時(shí)，水解過(guò)程就會(huì)變慢或停止。

83.同樣都是C18柱子，液相色譜柱和SPE他們之間有什么區(qū)別，能具體講一下么？
答：HPLC柱子和SPE小柱的對(duì)比：
對(duì)比項(xiàng)目            HPLC            SPE
柱管                 不銹鋼管        塑料管
粒徑（um）       3，5，10          40-300
顆粒形狀            球形          一般為無(wú)定形
柱效（塔板數(shù)）   20-25000           <100
分離機(jī)理          連續(xù)洗脫       數(shù)字式開(kāi)關(guān)洗脫
售價(jià)（元）       1000-4000          10-40
使用方式          可重復(fù)使用       一次性使用
操作成本          較高                    低
設(shè)備成本           高                      低
※對(duì)于C18固定相，為了提高回收率，SPE里用的C18填料一般載碳量相對(duì)更高。

84.我從上面了解到RP18和C18的區(qū)別是極性強(qiáng)一些，能問(wèn)一下他們?cè)诜治鲛r(nóng)藥是可不可以通用？C18適用于那些農(nóng)藥的分析？我查材料看到苯醚甲環(huán)唑都是用C18分析的，可我用C18分析發(fā)現(xiàn)響應(yīng)值很小，沒(méi)法分析能幫忙分析一下原因么？
答：RP18和普通C18，肯定有其不同的適應(yīng)性，農(nóng)藥種類(lèi)這么多，可能大部分農(nóng)藥兩者都能用，有些就不一定。你問(wèn)的C18適用于哪些農(nóng)藥，應(yīng)該從相關(guān)農(nóng)藥分析方面的書(shū)籍手冊(cè)中可以查到具體什么農(nóng)藥用什么色譜條件合適，其中里面肯定有選擇什么類(lèi)型柱子，我這邊沒(méi)辦法一一列舉。液相色譜中，60%以上的分析物可以用C18柱，我想也應(yīng)該有60%以上的農(nóng)藥可以用C18柱。
如果手冊(cè)或文獻(xiàn)中查不到，你把農(nóng)藥作為普通分析物來(lái)對(duì)待，然后按照一般的色譜柱選擇和方法建立原則來(lái)做就可以，選擇決定因素應(yīng)該也是農(nóng)藥分子的結(jié)構(gòu)。苯醚甲環(huán)唑，應(yīng)該含有極性基團(tuán)，可以試試極性強(qiáng)的C18柱。

85.我在用乙腈作流動(dòng)相時(shí)，只要那個(gè)乙腈比例稍高一點(diǎn)，比如，20%，即使，測(cè)量波長(zhǎng)高于乙腈截止波長(zhǎng)比較多，也會(huì)產(chǎn)生比較大的溶劑峰，這怎么回事？
答：如果出現(xiàn)溶劑峰，對(duì)你的分析結(jié)果沒(méi)任何影響，那就讓溶劑峰在那兒好了，或者你用規(guī)定的溶劑溶解提取樣品后，再用流動(dòng)相稀釋一下樣品，如果，稀釋后檢測(cè)限能達(dá)到的話(huà)。

86.我在做一個(gè)模擬胃內(nèi)容物中藥物反應(yīng)試驗(yàn)，需要?jiǎng)討B(tài)測(cè)定某藥品含量變化。分析時(shí)碰到一個(gè)棘手問(wèn)題，進(jìn)樣量同樣用20μL，用對(duì)照品進(jìn)樣時(shí)色譜峰形不錯(cuò)，進(jìn)樣品時(shí)卻一直不能得到好的峰形。后來(lái)分析是模擬胃內(nèi)容物樣品的酸度過(guò)高的因素，可我通過(guò)稀釋的方法讓樣品酸度和流動(dòng)相接近，雖然峰形沒(méi)問(wèn)題了，卻發(fā)現(xiàn)因稀釋導(dǎo)致分析物在樣品中含量下降，低于低檢測(cè)限了，如何是好呢？
 
答：稀釋很方便，但靈敏度更高的檢測(cè)器不容易找，不過(guò)還是有個(gè)簡(jiǎn)單的解決方案。當(dāng)用流動(dòng)相稀釋樣品時(shí)，只要稀釋后樣品中有機(jī)相含量比流動(dòng)相中的有機(jī)相比例低10個(gè)百分點(diǎn)以上（如，流動(dòng)相中甲醇含量是40%，則樣品中甲醇含量一定要低于30%），樣品流動(dòng)會(huì)被色譜柱進(jìn)口端延緩或阻擋，稱(chēng)為“柱上富集”。由于“柱上富集”作用的存在，這種情況下進(jìn)行大體積樣品進(jìn)樣，可避免樣品溶劑組成和流動(dòng)相一樣時(shí)進(jìn)樣量過(guò)大產(chǎn)生的“峰展寬”。針對(duì)你提的這個(gè)實(shí)例，可用稀的NaOH溶液調(diào)節(jié)樣品pH和流動(dòng)相匹配，并將樣品終稀釋一倍。將進(jìn)樣量提高一倍到40μL，就可達(dá)到低檢測(cè)限的要求。

87.峰形后拖尾是什么原因造成的？
答：
[柱物理?yè)p壞]
色譜柱有物理?yè)p壞是造成峰形拖尾的根源。wei一的解決方法就是更換新柱。

[柱內(nèi)填料污染]
流動(dòng)相和樣品中的雜質(zhì)是色譜柱主要污染源。
流動(dòng)相所用的各種溶劑至少是分析純，盡量使用色譜純?cè)噭?。流?dòng)相所用的水是超純水或全玻璃器皿雙蒸水。用前先用0.45μm溶劑微孔過(guò)濾（器）過(guò)濾，除去可能存在的微粒。流動(dòng)相建議現(xiàn)用現(xiàn)配，對(duì)于含鹽的溶液尤其注意長(zhǎng)置會(huì)產(chǎn)生細(xì)菌或出現(xiàn)沉淀。此外還得保證儲(chǔ)存流動(dòng)相的容器清潔。
 復(fù)雜樣品可選用0.45μm溶劑微孔過(guò)濾（器）或樣品預(yù)處理柱對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，確保樣品中不含微粒雜質(zhì)。若樣品不便處理，要使用保護(hù)柱。柱內(nèi)填料污染時(shí)，可將柱頭螺絲卸下，用工具挖出柱內(nèi)前段被污染填料，再以相同的填料重新填入，修復(fù)，或以能溶解污染物的流動(dòng)相按色譜柱使用的相反方向，沖洗色譜柱（約20至30倍柱體積，或視具體情況而定；另外，此時(shí)不能接檢測(cè)器），將污染物沖出色譜柱，再按色譜柱標(biāo)明的使用方向使用。

[柱進(jìn)口處有異物]
 當(dāng)斷定是柱進(jìn)口處有異物時(shí)，可將柱頭螺絲卸下，取出濾帽并將其置于20%硝酸溶液中，用超聲波清洗約20分鐘，再置于超純水中，并用超聲波清洗約10分鐘，重新裝入色譜柱內(nèi)即可。

[樣品濃度過(guò)高致使柱超載]
樣品在柱上超載能引起峰展寬，拖尾（或伸舌）。
適當(dāng)減小進(jìn)樣量或樣品濃度（需要時(shí)，可提高檢測(cè)器靈敏度）直至峰形和保留時(shí)間不再改變，便可消除這種不良影響。減小進(jìn)樣量還能改善其分離度。正常情況下，樣品中每種化合物在150×4.6mm柱中進(jìn)樣量保持在3～50μg范圍內(nèi)，不會(huì)引起明顯超載。

[樣品溶劑不對(duì)]
選擇合適的樣品溶劑，以排除不必要的干擾，選用流動(dòng)相溶解樣品。

[柱外效應(yīng)]
柱外效應(yīng)（即，進(jìn)樣閥、色譜柱及檢測(cè)器間的管路過(guò)長(zhǎng)、直徑過(guò)粗、管路接頭不匹配、有死體積）是影響色譜柱柱效的主要因素之一，所以，在可能的條件下，色譜柱的兩端連接管路要盡可能短，連接管內(nèi)徑盡可能細(xì)小，切口務(wù)必平整光滑，盡可能的減小死體積，以防止因樣品擴(kuò)散造成不能反映色譜柱真實(shí)柱效等情況發(fā)生。

[緩沖不足或不合適]
在緩沖不好或離子強(qiáng)度過(guò)低的分離中，也會(huì)出現(xiàn)保留時(shí)間重現(xiàn)性差和峰形拖尾。增加緩沖濃度（與樣品大小相匹配）能改善此情況。

[硅醇基團(tuán)作用]
仔細(xì)分析色譜柱內(nèi)填料表面性質(zhì)可知：反相色譜柱填料的表面大約被鍵合相覆蓋了一半，其余的就是未被鍵合的硅醇基團(tuán)。所謂的保留是指樣品分子與鍵合相相互作用的結(jié)果。但是，酸性或堿性化合物與硅膠表面殘存的硅醇基團(tuán)或金屬雜質(zhì)之間相互作用而引起雙重保留機(jī)理，因此，發(fā)生了峰形拖尾。
為了減小峰形拖尾，通?？稍诹鲃?dòng)相加入25mM三乙胺（抑制劑）。三乙胺能與硅醇基團(tuán)發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用，從而降低或阻斷樣品分子與硅醇基團(tuán)的作用，以保證保留機(jī)理正常進(jìn)行，并大大緩解了峰形拖尾。使用長(zhǎng)鏈的硅醇基抑制劑，雖起效較慢，但，持續(xù)力較三乙胺長(zhǎng)。因?yàn)橐种苿┓肿又谐税坊c硅醇基團(tuán)發(fā)生極性作用外，大分子中非極性部分與固定相也會(huì)發(fā)生反相作用而產(chǎn)生保留現(xiàn)象。如果，將抑制劑加至樣品中，效果會(huì)顯著。

[柱內(nèi)金屬污染]
柱內(nèi)金屬污染（Fe，Ni等）可引起某引些化合物峰形拖尾。金屬可由填料本身帶進(jìn)，也可由腐蝕性流動(dòng)相緩慢溶解柱進(jìn)口的金屬濾片，隨流動(dòng)相沉積到柱填料中，例如，C18柱填料被金屬污染后，造成酸性/堿性樣品拖尾，可用堿洗/酸洗后再鍵合的填料，得到的峰是尖銳且對(duì)稱(chēng)的。

88.流動(dòng)相與柱子如何才能做到匹配，達(dá)到的分離效果。目前我們實(shí)驗(yàn)室有購(gòu)買(mǎi)好的色譜柱，可是對(duì)樣品的分離效果不是很好。
答：不同填料的色譜柱都有自己的選擇性，相同填料不同廠(chǎng)家以及相同廠(chǎng)家不同品牌之間的選擇性都是不一樣的，一般情況下根據(jù)物質(zhì)的性質(zhì)將分離的大方向如：正相分析或者反相分析，確定后，一般可以根據(jù)調(diào)節(jié)色譜條件能得到好的色譜峰形，這方面的資料論壇當(dāng)中很多，但是也有些色譜柱不管怎么調(diào)整色譜條件都不行，表面這款色譜柱的選擇性不適合該樣品的選擇。

89.我用的是C18柱，后面黑色的是我以前跑的圖，前面是我現(xiàn)在跑的圖形，*一樣的東西，只是流動(dòng)相不是一批配的（流動(dòng)相的成分沒(méi)變），中間柱子別人用過(guò)了，峰型怎么發(fā)生了這么大的變化??？可能的原因是什么?。渴遣皇侵映隽藛?wèn)題?。?br />答：從兩個(gè)圖對(duì)比很明顯可以看出是柱效嚴(yán)重下降，且伴有肩峰。不同時(shí)間配的流動(dòng)相，如果成分和pH沒(méi)變的話(huà)，肯定不會(huì)造成這個(gè)結(jié)果。估計(jì)是別人用柱子過(guò)程中，造成了柱頭塌陷、柱頭污染以及固定相流失等嚴(yán)重問(wèn)題，如樣品太臟，流動(dòng)相或樣品pH太高或太低，都會(huì)造成這個(gè)結(jié)果。
你可以試著用色譜柱清洗和再生的方法反沖維護(hù)一下，但不能保證一定能回到原來(lái)的效果。再生如果不行，考慮挖補(bǔ)柱頭填料，實(shí)在不行，柱子也只能報(bào)廢。建議柱子還是專(zhuān)門(mén)用于一種方法比較好，像你這種情況，都搞不清別人怎么用柱子的，分析解決問(wèn)題就相當(dāng)難。

90.柱子的柱效影響大嗎？一般柱子的柱效規(guī)定是多少的呀！理論塔板數(shù)一般要達(dá)到多少呢？主要有那些因素影響它。
答：柱效是柱子性能好壞的一個(gè)重要體現(xiàn)指標(biāo)。柱效會(huì)影響分離度，當(dāng)然是峰形越尖銳，柱效越高，和其它峰越容易分開(kāi)。另外柱效高峰形尖銳，對(duì)峰面積的積分誤差就小，甚至可以用峰高來(lái)定量。
一般C18柱，在測(cè)定甲苯等不易拖尾的小分子中性不電離物質(zhì)時(shí)，5μm的填料，每米的柱效能達(dá)到80000以上的塔板數(shù)，就算合格吧。在實(shí)際分析物的測(cè)定時(shí)，一般藥典有規(guī)定低柱效是2000～3000，一般新柱子的柱效都高于這個(gè)數(shù)。但柱子在使用后，由于固定相流失等原因，柱效會(huì)逐步下降，當(dāng)下降到不符合藥典低柱效要求，或者導(dǎo)致分離度不夠時(shí)，色譜柱就算壽命到了。單從柱效逐步下降這個(gè)角度看，柱效高的色譜柱相對(duì)使用壽命更長(zhǎng)。
影響柱效的因素有粒徑、粒徑和孔徑分布、固定相鍵合密度、柱外體積和溫度等，柱子裝填緊密、柱床均勻一致也對(duì)提高柱效有好處。這些影響因素中，很多是和生產(chǎn)廠(chǎng)商有關(guān)，你這邊能做的是盡量減少柱外連接體積。

91.流動(dòng)相中加入si qing fu nan對(duì)柱子有損害嗎?我現(xiàn)在分析一樣品流動(dòng)相中用到20%的si qing fu nan才能把峰分到基線(xiàn).但柱子只能用一個(gè)星期分離效果就不好了.請(qǐng)問(wèn)是si qing fu nan損壞了柱子嗎?
答：si qing fu nan（THF）是反相色譜中洗脫能力*的溶劑，比甲醇和乙腈都強(qiáng)很多。在流動(dòng)相中加入THF能改善某些難分離的物質(zhì)對(duì)的分離度，但，THF不穩(wěn)定，容易降解生成具有很強(qiáng)反應(yīng)活性的過(guò)氧化物，能與分析物反應(yīng)生成新化合物，導(dǎo)致拖尾、峰分裂和鬼峰產(chǎn)生。高反應(yīng)活性的過(guò)氧化物還可以和填料固定相發(fā)生化學(xué)作用，THF對(duì)柱子有損傷這點(diǎn)是無(wú)疑的，而且這種損傷是隨時(shí)間累積的。THF保質(zhì)期一般規(guī)定是6個(gè)月，放得越久，里面產(chǎn)生的過(guò)氧化物含量越大，你應(yīng)該避免使用生產(chǎn)日期已很久的THF溶劑，而且將THF冷藏、干燥和避光保存，使用前能檢測(cè)一下過(guò)氧化物的含量。

92.在用液相色譜同時(shí)分離多種組分時(shí)，怎么通過(guò)條件色譜條件使各個(gè)峰達(dá)到比較理想的分離效果！
答：這是方法開(kāi)發(fā)的大問(wèn)題。方法開(kāi)發(fā)建立，要做的就是：針對(duì)分析物和基體的情況不同，選擇色譜柱類(lèi)型和分析條件，包括流動(dòng)相溶劑類(lèi)型、組成比例、pH值、溫度和流速等參數(shù)的確定。這方面的問(wèn)題，要講起來(lái)內(nèi)容非常多。

93.是樣品過(guò)載問(wèn)題,按藥典檢測(cè)方法檢驗(yàn)一些藥品有關(guān)物質(zhì)時(shí),都要注入高濃度的供試液,這樣往往使得柱過(guò)載而峰變形,按老師的方法減小濃度和注入量均是不允許的,怎么處理這問(wèn)題?
答：藥典方法中注入高濃度供試液測(cè)定有關(guān)物質(zhì)，提高注入濃度是為了把雜質(zhì)峰的信號(hào)增強(qiáng)。有時(shí)候?yàn)榱税央s質(zhì)峰顯現(xiàn)出來(lái)，主峰因過(guò)載有所變形，如在允許范圍內(nèi)，也能接受。但前提是雜質(zhì)峰和樣品主峰分開(kāi)，如果因過(guò)載而使兩峰沒(méi)有得到需要的分離度，雜質(zhì)峰信號(hào)再?gòu)?qiáng)也失去了意義。我認(rèn)為藥典規(guī)定的條件是允許在一定范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)節(jié)的，因?yàn)樗幍錄](méi)有規(guī)定具體使用色譜柱的品牌，而不同品牌的柱子，上樣量是有差異的。對(duì)色譜條件微調(diào)，并取得到了很好的分析結(jié)果，如果規(guī)定不允許，那你首先要懷疑這個(gè)規(guī)定是否合理，或者是否對(duì)規(guī)定的理解有問(wèn)題。

94.哪些原因會(huì)造成色譜峰變寬、峰高變低，有哪些解決辦法？
答：確實(shí)是這樣，如果其它色譜條件沒(méi)有改變，柱效下降是導(dǎo)致峰變寬的主要原因。對(duì)于易電離的極性物質(zhì)，如果流動(dòng)相pH選擇不合適，分析物既有中性分子態(tài)存在，又有離子態(tài)存在，峰也會(huì)變寬變矮。
色譜柱使用后柱效逐步下降是正?，F(xiàn)象，如突然降低則屬異常。柱效下降原因有很多，但柱效快速下降則多半是使用不當(dāng)，造成填料特性或柱床結(jié)構(gòu)改變所致。如超過(guò)使用pH范圍造成的固定相和硅膠基體的流失、柱床塌陷等；還有強(qiáng)保留物質(zhì)吸附在填料表面，形成非特異性吸附層，*改變了原有固定相的表面活性和分離性能，使柱效下降；另外進(jìn)樣時(shí)的壓力脈沖，也會(huì)破壞柱床結(jié)構(gòu)影響柱效。

95.我以前做su丹紅用的是安捷倫的SB-C18柱，峰形什么都很好，近發(fā)現(xiàn)4個(gè)標(biāo)樣峰后都帶有一個(gè)小峰，一開(kāi)始以為是標(biāo)樣問(wèn)題，后來(lái)?yè)QXDB-C18后標(biāo)樣又正常了?？墒怯肧B-C18柱做其他用正常，不知怎么回事？還有，像這種C18柱如果壓力過(guò)高能不能反沖，該如何沖洗？一般做獸殘、農(nóng)殘什么的，而且感覺(jué)三聚氰胺做后壓力更易增高，且容易引發(fā)進(jìn)樣器漏等問(wèn)題，請(qǐng)問(wèn)做完三聚氰胺需對(duì)系統(tǒng)做特殊清洗嗎？
答：用SB柱，標(biāo)樣后帶一小峰，而且是只對(duì)su丹紅標(biāo)樣測(cè)定時(shí)有，估計(jì)和su丹紅標(biāo)樣的測(cè)定方法和其它樣品測(cè)定方法不同有關(guān)。能把譜圖貼上來(lái)看看，是什么樣的小峰？才能判斷是溶劑峰還是雜質(zhì)峰。XDB柱和SB柱是有區(qū)別的，XDB鍵合度高，封尾良好，反相保留能力強(qiáng)；而SB柱，未進(jìn)行封尾，對(duì)極性物質(zhì)選擇性好。有可能你的su丹紅標(biāo)樣分解了，有極性雜質(zhì)生成，SB柱能把雜質(zhì)分開(kāi)，而XDB柱不能。
這兩款柱子壓力大了，可以反沖。有正常維護(hù)時(shí)的反沖沖洗和再生時(shí)的強(qiáng)溶劑沖洗兩種，沖洗方法在在線(xiàn)講座里也寫(xiě)了，你再回到本貼的前面看看就可以了。
三聚氰胺和三乙胺類(lèi)似，本身容易和硅醇基作用而吸附在填料表面，另外三聚氰胺測(cè)定的樣品基體含蛋白類(lèi)的強(qiáng)保留物質(zhì)較多，容易污染色譜柱柱頭引起填料間隙堵塞柱壓升高，每次做完樣后，都用甲醇或乙腈反向清洗維護(hù)一下。如有蛋白類(lèi)的污染，也定時(shí)用本講座中提到的清洗方法做一下維護(hù)。

96.我是做農(nóng)藥殘留分析的，不同的基質(zhì)雜質(zhì)含海量是不同的，我用C18分析時(shí)有可能一次就污染了，我用高流速，和反向沖洗都解決不了，是不是這根柱子就廢了，有沒(méi)有其他的辦法？
答：高流速反向沖洗是對(duì)的，關(guān)鍵你用了什么溶劑沖洗呢？用原來(lái)的流動(dòng)相沖洗肯定不管用，要不然就不會(huì)累積在柱子上了。你應(yīng)該用流動(dòng)相中的強(qiáng)溶劑B沖洗，如果不行，就需要啟用再生的程序，當(dāng)然再生時(shí)用的溶劑更強(qiáng)。
100％甲醇——100％乙晴——75％乙晴/25％異丙醇——100％異丙醇——100％二氯甲烷——100％正己烷。
用每種溶劑沖洗至少10個(gè)柱體積，對(duì)于250mm×4.6mm的分析柱，合適的沖洗流速是1～2mL/min。后，用10柱體積的異丙醇過(guò)渡，然后回到原來(lái)的流動(dòng)相體系。
再生還不解決問(wèn)題，后一招就是挖補(bǔ)柱頭填料，把柱頭污染的填料挖掉，用干凈填料填補(bǔ)進(jìn)去。挖補(bǔ)填料，破壞原有柱床結(jié)構(gòu)，挖補(bǔ)后柱效也不可能有新柱水平，或許能再維持一段時(shí)間，但不會(huì)長(zhǎng)久。

97.還有溶劑中的金屬過(guò)濾頭生銹了，會(huì)有什么影響？會(huì)不會(huì)影響到柱子的壽命，金屬離子和柱子有沒(méi)有什么反應(yīng)？
答：我覺(jué)得你就把銹當(dāng)成顆粒物污染的一種，會(huì)導(dǎo)致拖尾、柱壓上升等。溶解的金屬離子一般在反相柱上沒(méi)有什么保留能力，馬上就會(huì)被沖出柱子，不會(huì)和固定相或者和硅膠基質(zhì)反應(yīng)。

98.如果在溶劑過(guò)濾時(shí)把水膜當(dāng)成有機(jī)膜了溶解了而且這樣的溶劑又做有機(jī)相用了，造成C18柱壓由1000升到3000，流動(dòng)相是乙腈和水，問(wèn)一下這樣的柱子還能用么？有沒(méi)有什么補(bǔ)救方法？
答：溶解的膜作為了顆粒物堵塞篩板，引起柱壓上升，也只有反沖一下，如果能把堵在篩板上的膜殘?jiān)鼪_走，柱壓下降了就OK了；如果，殘?jiān)M(jìn)入了柱子內(nèi)部的填料間隙，會(huì)難沖一點(diǎn)，也只能多沖一會(huì)吧，實(shí)在不行，你又舍不得把色譜柱報(bào)廢，就只有挖補(bǔ)柱頭填料和換篩板了。

99.保護(hù)柱和預(yù)柱的作用是不是一樣的，如果不一樣有什么區(qū)別么？保留時(shí)間漂移多少為可以接受的范圍？
答：保護(hù)柱一般帶填料，相當(dāng)于一根縮短了的色譜柱（一般是1～2cm長(zhǎng)度），卡套里可更換的柱芯，柱管、篩板和填料都有。保護(hù)柱里的柱芯好像是在前面開(kāi)路的掃雷budui，流動(dòng)相和樣品里如有什么損害柱子的污染物，保護(hù)柱就自己承受了下來(lái)。
而預(yù)柱，現(xiàn)在一般指的就是接在進(jìn)樣器和色譜柱之前的在線(xiàn)過(guò)濾器。在線(xiàn)過(guò)濾器和保護(hù)柱的大區(qū)別是不帶填料，只有可更換的篩板。預(yù)柱只能保護(hù)色譜柱免受顆粒物質(zhì)的污染，而不能阻擋溶解在流動(dòng)相中的強(qiáng)保留物質(zhì)。
保留時(shí)間是液相色譜中一個(gè)很有用的診斷分離問(wèn)題的工具。保留時(shí)間受流動(dòng)相組成、溫度、pH、流速、固定相流失和柱老化等很多因素的影響，如果所有這些參數(shù)保持不變，保留時(shí)間也保持恒定。但在實(shí)際操作中，不可能對(duì)每個(gè)色譜參數(shù)進(jìn)行很的控制，如即便加了柱溫箱，溫度還是會(huì)有波動(dòng)；流動(dòng)相組成會(huì)因組分揮發(fā)性不同而改變。
所以，保留時(shí)間有上下0.02～0.05min的變動(dòng)是非常正常的，對(duì)某些方法有0.1min上下變動(dòng)也屬正常。保留時(shí)間有大的變化，預(yù)示著系統(tǒng)和方法存在問(wèn)題。流路里有氣泡存在，泵閥有泄漏，會(huì)因流量降低而導(dǎo)致保留時(shí)間增加。梯度混合比例閥故障也是保留時(shí)間變化原因之一。

100.液相色譜柱與氣相的柱子有何區(qū)別呢？
HPLC是走液體的。分正相，反相。反相為例。Si接著C18（鍵和相）,電鏡下看起來(lái)像絨毛一樣的。所以一般用甲醇，乙腈保護(hù)RP柱。這樣它的絨毛呈舒展?fàn)?，GC走氣體的。固定相涂布固定液。