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          液相色譜儀的日常應(yīng)用原理

          閱讀:5049        發(fā)布時(shí)間:2012-11-9
            液相色譜儀的原理
            
            液相色譜儀主要有進(jìn)樣系統(tǒng)、輸液系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),下面將分別敘述其各自的組成與特點(diǎn)。
            
            1.進(jìn)樣系統(tǒng)一般采用隔膜注射進(jìn)樣器或高壓進(jìn)樣間完成進(jìn)樣操作,進(jìn)樣量是恒定的。這對(duì)提高分析樣品的重復(fù)性是有益的。
            
            2.輸液系統(tǒng)該系統(tǒng)包括高壓泵、流動(dòng)相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強(qiáng)為l.47~4.4X107Pa,流速可調(diào)且穩(wěn)定,當(dāng)高壓流動(dòng)相通過(guò)層析柱時(shí),可降低樣品在柱中的擴(kuò)散效應(yīng),可加快其在柱中的移動(dòng)速度,這對(duì)提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動(dòng)相貯存錯(cuò)和梯度儀,可使流動(dòng)相隨固定相和樣品的性質(zhì)而改變,包括改變洗脫液的極性、離子強(qiáng)度、PH值,或改用競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質(zhì)(即使僅有一個(gè)基團(tuán)的差別或是同分異構(gòu)體)都能獲得有效分離。
            
            3.分離系統(tǒng)該系統(tǒng)包括色譜柱、連接管和恒溫器等。色譜柱一般長(zhǎng)度為10~50cm(需要兩根連用時(shí),可在二者之間加一連接管),內(nèi)徑為2~5mm,由"不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成,住內(nèi)裝有直徑為5~10μm粒度的固定相(由基質(zhì)和固定液構(gòu)成).固定相中的基質(zhì)是由機(jī)械強(qiáng)度高的樹(shù)脂或硅膠構(gòu)成,它們都有惰性(如硅膠表面的硅酸基因基本已除去)、多孔性(孔徑可達(dá)1000?)和比表面積大的特點(diǎn),加之其表面經(jīng)過(guò)機(jī)械涂漬(與氣相色譜中固定相的制備一樣),或者用化學(xué)法偶聯(lián)各種基因(如磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長(zhǎng)度碳鏈的烷基等)或配體的有機(jī)化合物。因此,這類(lèi)固定相對(duì)結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)有良好的選擇性。例如,在多孔性硅膠表面偶聯(lián)豌豆凝集素(PSA)后,就可以把成纖維細(xì)胞中的一種糖蛋白分離出來(lái)。
            
            另外,固定相基質(zhì)粒小,柱床極易達(dá)到均勻、致密狀態(tài),極易降低渦流擴(kuò)散效應(yīng)?;|(zhì)粒度小,微孔淺,樣品在微孔區(qū)內(nèi)傳質(zhì)短。這些對(duì)縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。根據(jù)柱效理論分析,基質(zhì)粒度小,塔板理論數(shù)N就越大。這也進(jìn)一步證明基質(zhì)粒度小,會(huì)提高分辨率的道理。再者,液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調(diào)到60C,通過(guò)改善傳質(zhì)速度,縮短分析時(shí)間,就可增加層析柱的效率。
            
            液相色譜儀應(yīng)用過(guò)程中常見(jiàn)問(wèn)題解析
            
            1.液相色譜儀系統(tǒng)
            
            液相色譜儀主要由貯液瓶、泵、進(jìn)樣器、柱子、柱溫箱、檢測(cè)器、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。對(duì)于整個(gè)系統(tǒng)而言,柱子、泵和檢測(cè)器是核心部件同時(shí)也是易出問(wèn)題的主要部位。
            
            2.常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法
            
            液相作為一種高精密儀器,如果在使用過(guò)程中不按照正確操作的話(huà),就容易導(dǎo)致一些問(wèn)題。其中zui常見(jiàn)的就是柱壓?jiǎn)栴}、漂移問(wèn)題、峰型異常問(wèn)題。
            
            2.1柱壓?jiǎn)栴}
            
            柱壓?jiǎn)栴}是使用液相色譜過(guò)程中需要密切注意的地方,柱壓的穩(wěn)定與色譜圖峰形的好壞、柱效、分離效果及保留時(shí)間等密切相關(guān)。所謂柱壓穩(wěn)定并不是指壓力值穩(wěn)定于一個(gè)恒定值而是指壓力波動(dòng)范圍在50PSI(3.3Bar)之間(在使用梯度洗脫時(shí),柱壓平穩(wěn)緩慢的變化是允許的)。壓力過(guò)高、過(guò)低都屬于柱壓?jiǎn)栴}。
            
            2.1.1壓力過(guò)高
            
            這是液相在使用中zui常見(jiàn)的問(wèn)題,指的是壓力突然升高,一般都是由于流路中有堵塞的原因。此時(shí),我們應(yīng)該分段進(jìn)行檢查。
            
           ?。?).首先斷開(kāi)真空泵的入口處,此時(shí)PEEK管里充滿(mǎn)液體,使PEEK管低于溶劑瓶,看液體是否自由滴下,如果液體不滴或緩慢滴下,則是溶劑過(guò)濾頭堵塞。處理方法:用30%的硝酸浸泡半個(gè)小時(shí),在用超純水沖洗干凈。如果液體自由滴下,溶劑過(guò)濾頭正常,在檢查;
            
            (2).打開(kāi)Purge閥,使流動(dòng)相不經(jīng)過(guò)柱子,如果壓力沒(méi)有明顯下降,則是過(guò)濾白頭堵塞。處理方法:將過(guò)濾白頭取出,用10%的異丙醇超聲半個(gè)小時(shí)。如果壓力降至100PSI(6.7Bar)以下,過(guò)濾白頭正常,在檢查;
            
           ?。?).把色譜柱出口端取下,如果壓力不下降,則是柱子堵塞。處理方法:如果是緩沖鹽堵塞,則用95%的水沖至壓力正常。如果是一些強(qiáng)保留的物質(zhì)導(dǎo)致堵塞,則要用比現(xiàn)在流動(dòng)相更強(qiáng)的流動(dòng)相沖至壓力正常。假如按上面的方法長(zhǎng)時(shí)間沖洗壓力都不下降,則可考慮將柱子的進(jìn)出口反過(guò)來(lái)接在儀器上,用流動(dòng)相沖洗柱子。這時(shí),如果柱壓仍不下降,只有換柱子入口篩板,但一旦操作不甚,很容易造成柱效下降,所以盡量少用。
            
            2.1.1壓力過(guò)低
            
            壓力過(guò)低的現(xiàn)象一般是由于系統(tǒng)泄漏,處理方法:尋找各個(gè)接口處,特別是色譜柱兩端的接口,把泄漏的地方旋緊即可。當(dāng)然還有一個(gè)原因就是泵里進(jìn)了空氣,但此時(shí)表現(xiàn)的往往是壓力不穩(wěn),忽高忽低,更嚴(yán)重一點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致泵無(wú)法吸上液體。處理方法:打開(kāi)Purge閥,用3~5ml/min的流速?zèng)_洗,如果不行,則要用針筒在排空閥處借住外力將氣泡吸出。
            
            液相色譜儀儀器各部分日常簡(jiǎn)易保養(yǎng)及維護(hù)
            
            1、流動(dòng)相的抽濾要求
            
            色譜純?cè)噭?,二次蒸餾水,緩沖鹽一定要過(guò)濾。
            
            2、吸濾頭
            
            特殊情況下可拆下濾頭抽取以判斷其中是否堵塞;亦可用注射器吸取流動(dòng)相通過(guò)吸濾頭打出以判斷其是否堵塞。若有堵塞情況可用異丙醇超聲波清洗;清洗不成功則需要更換。
            
            3、單向閥
            
            如遇到泵壓不穩(wěn)或流動(dòng)相不能抽取,則可能是單向閥出現(xiàn)問(wèn)題,卸下用異丙醇超聲波清洗,清洗時(shí)須按其安裝的反相放置在小燒杯中,切記不可與安裝方向倒置超洗!
            
            4、泵頭
            
            泵頭漏液或出現(xiàn)其它故障一般要申請(qǐng)維修(如漏液,或更換柱塞桿及其密封墊等)。
            
            5、過(guò)濾片
            
            當(dāng)色譜峰出現(xiàn)異常情況時(shí),有可能是此部件被污染,拆下用異丙醇超洗或更換過(guò)濾墊片。
            
            6、排液閥
            
            此處不能*密封或漏液時(shí)一般是其中的墊片污染或磨損,可卸下后取出其墊片用異丙醇超聲波清洗或更換墊圈。
            
            7、手動(dòng)進(jìn)樣器
            
            平時(shí)應(yīng)注意用二次蒸餾水和甲醇在裝載狀態(tài)及進(jìn)樣分析狀態(tài)清洗;如出現(xiàn)漏液現(xiàn)象,原因極可能為轉(zhuǎn)子密封墊磨損或污染,一般須申請(qǐng)維修或更換配件。
            
            8、流通池
            
            在色譜峰不正常時(shí)可能是此部件被污染可拆卸后取出其中的墊片用異丙醇超洗(可根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作或申請(qǐng)維修)。
            
            9、工作站
            
            出現(xiàn)死機(jī)可重啟計(jì)算機(jī);不正常運(yùn)行時(shí),首先可更換電腦測(cè)試其硬件故障;或在本機(jī)上重新插撥接口、重新安裝軟件。

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