尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG酶）說明書

Uracil-N-Glycosylase

Cat. No.   K0951

保存：-20℃

組分說明

Cat.No.              K0951      K0951A

KitSize               200U      5×200U

 Uracil-N-Glycosylase，1U/μl        200 μl    5×200 μl

產(chǎn)品簡介

     尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG酶）也稱為尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG酶），通過大腸桿菌表達(dá)純化的重組酶，該蛋白分子量為25kD，可催化含尿嘧啶的單鏈和雙鏈DNA釋放游離尿嘧啶，并且對RNA無活性，主要應(yīng)用于防止PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。該酶作用機(jī)理為：在PCR反應(yīng)中以dUTP代替dTTP，擴(kuò)增產(chǎn)物片段中的T全部被U取代，形成了含dU堿基的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。UNG酶能選擇性斷裂單鏈和雙鏈DNA中U堿基的糖苷鍵，降解反應(yīng)體系中含U的DNA，有效消除PCR產(chǎn)物的殘留污染，大大降低擴(kuò)增產(chǎn)物污染導(dǎo)致的假陽性，從而保證擴(kuò)增的特異性和準(zhǔn)確性。

單位定義

     37℃，60分鐘內(nèi)催化1nmol尿嘧啶，從含尿嘧啶的DNA上釋放所需要的酶量定義為一個單位。

質(zhì)量控制

     SDS-PAGE檢測純度大于95%；經(jīng)檢測無核酸內(nèi)、外切酶活性。

注意事項

1. UNG長期儲存(非頻繁使用; 每月少于3次)請置于-70℃保存，每天或每周使用請于-20℃保存。盡量避免反復(fù)凍融，大包裝建議分裝使用。

2.UNG可以在PCR反應(yīng)前先清除不慎污染的U-DNA分子，一個實驗室必須在所有的PCR反應(yīng)中使用dUTP作為dNTP之 一，使所有擴(kuò)增產(chǎn)物都成為U-DNA。如單使用于某個檢測，T-DNA仍會積累，此抗污染系統(tǒng)也難以起到*的作用。

3. UNG/dUTP系統(tǒng)是PCR試劑內(nèi)部的一種防污染措施，為了防止PCR產(chǎn)物的污染，尤其是在臨檢實驗室中反復(fù)放大同一片段時，必須嚴(yán)格規(guī)范實驗室的分劃和操作。  

使用方法

以下舉例為常規(guī)的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，實際操作中應(yīng)根據(jù)具體實驗進(jìn)行相應(yīng)的改進(jìn)和優(yōu)化。

1.  PCR反應(yīng)體系：

試劑                     50μl反應(yīng)體系               終濃度

TaqPCRBuffer，10×                   5μl                1×

dATP，10mM                       1μl              200μM 

dGTP，10mM                       1μl              200μM

dCTP，10mM                        1μl              200μM

    

dTTP，10mM                      0.5 μl            100μM

    

dUTP，10mM                        1μl              200μM

    

ForwardPrimer，10μM                  1μl            0.2μM

ReversePrimer，10μM                  1μl             0.2μM

TemplateDNA                         Xμl                  

                                            ，

TaqDNAPolymerase       5U/μl         0.5μl                 

Uracil-N-Glycosylase，1U/μl             0.2μl                 

    

RNase-FreeWater                  upto50 μl              

    

    注意：TaqDNAPolymerase與Uracil-N-Glycosylase的反應(yīng)緩沖液和酶儲存液可以通用。

2.  PCR 反應(yīng)條件： 

     

步驟               溫度             時間

    

UNG消化          37℃-50℃        5-10min

    

預(yù)變性               95℃           10min

    

變性               94℃            30s

退火             55-65℃           30s         30-40 個循環(huán)

延伸              72℃           1min

    

延伸

    注意：通常將Taq酶與UNG酶按一定的比例加入終PCR反應(yīng)體系中，先于72℃37℃-50℃范圍內(nèi)消化 5min5-10分鐘，然后95℃10分鐘滅活，（同時這一步也達(dá)到預(yù)變性和熱啟動的效果），隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。UNG酶的反應(yīng)可以在37℃-50℃，5-10分鐘的范圍內(nèi)變化，可以根據(jù)實驗的需要進(jìn)行調(diào)整。

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