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  本試劑盒是利用熒光染料（bisbenzimide,Hoechst 33258）檢測支原體污染。這種染料會結(jié)合到DNA的A-T富集區(qū)域，因?yàn)橹гw的DNA中A-T含量高（55％～80％），所以可將其染色而被檢測到。被支原體污染的細(xì)胞經(jīng)染色后在細(xì)胞周圍可看到許多大小均一的熒光小點(diǎn)，即為支原體的DNA染色斑，說明有支原體污染。Hoechst 33258的最大激發(fā)波長為346nm，最大發(fā)射波長為460nm；Hoechst 33258和雙鏈DNA結(jié)合后，最大激發(fā)波長為352nm，最大發(fā)射波長為461nm。

操作步驟：

貼壁細(xì)胞：

1.被檢細(xì)胞接種于無菌的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種密度為1-2×104。同時，接種正常無支原體感染的同種細(xì)胞，作為陰性對照。

2.5天后，先吸去培養(yǎng)液，再加入1ml的固定液，靜置20min，

3.吸去固定液，晾干。

4.于每孔中，加入1ml的Hoechst33258工作液（Hoechst 33258工作液須覆蓋全部被檢細(xì)胞），37℃避光放置15-20min或室溫靜置20～30min。

5.吸去Hoechst 33258工作液，加入2ml滅菌超純水洗滌三次，直接風(fēng)干。風(fēng)干后加入一滴封片液，并以蓋玻片覆蓋。

6.熒光顯微鏡觀察。用紫外激發(fā)光激發(fā)，觀察細(xì)胞周圍是否有藍(lán)色熒光小點(diǎn)或串珠狀熒光小點(diǎn)。

懸浮細(xì)胞：

1.收集需檢測的細(xì)胞，1500rpm，5min。

2.將收集的細(xì)胞涂片于載玻片上，再加1ml的固定液，靜置20min。

3.吸去固定液，晾干。

4.于每孔中，加入1ml的Hoechst33258工作液（Hoechst 33258工作液須覆蓋全部被檢細(xì)胞），37℃避光放置15～20min或室溫靜置20～30min。

5.吸去Hoechst 33258工作液，用無菌水洗滌玻片3次，直接風(fēng)干。風(fēng)干后加入一滴封固液，并以蓋玻片覆蓋。

6.熒光顯微鏡觀察。用紫外激發(fā)光激發(fā)，觀察細(xì)胞周圍是否有藍(lán)色熒光小點(diǎn)或串珠狀熒光小點(diǎn)。

結(jié)果判斷（參考）：

陰性：僅見細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)黃綠色熒光。

陽性：除細(xì)胞外，細(xì)胞周圍可見大量的大小均一的熒光著色顆粒。

注意事項(xiàng)：

1.Hoechst工作液對人體有害，請注意防護(hù)。

2.固定液有刺激性氣味，建議在通風(fēng)櫥進(jìn)行固定。

3.支原體檢測時，最好用不含抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)2～3代，這樣容易避免假陰性結(jié)果。

4.本試劑盒用于6孔板檢測時，可以進(jìn)行50次檢測反應(yīng)。

5.檢測支原體污染，可以使用支原體高效Vero細(xì)胞，這樣可以提高檢測靈敏度，即將被檢測樣品接種于Vero細(xì)胞進(jìn)行檢測。