用淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞

1）分離外周血中的單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）

1．抽取正常人靜脈血加到肝素抗凝管中，加等量含5～10IU/ml肝素的無(wú)血清緩沖液懸浮細(xì)胞。將細(xì)胞懸液小心加在與血液等量的淋巴細(xì)胞分離液上，室溫中，水平離心500×g 20分鐘。此時(shí)離心管中形成5層：zui上面是血漿，血漿層和淋巴細(xì)胞分離液之間是PBMC，淋巴細(xì)胞分離液層和zui下面的紅細(xì)胞層之間是粒細(xì)胞層，又成為棕黃層。

2．吸去zui上層的血漿，收集血漿層和淋巴細(xì)胞分離液交界面的單個(gè)核細(xì)胞，盡量全部吸出PBMC。加1～2倍量含5IU/ml肝素、2％滅活小牛血清的Hanks液（洗滌液），混勻后離心200×g 10分鐘，低速離心有利于去除細(xì)胞懸液中留存的血小板，去上清液。

3．再用同樣洗滌液洗滌細(xì)胞2次，每次離心500×g 10分鐘，洗去殘留的淋巴細(xì)胞分離液。用1％臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力（應(yīng)>95％）并計(jì)數(shù)細(xì)胞。再用含10％小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞配成適當(dāng)濃度。通常，每毫升外周血可得1×10⁶～2×10⁶PBMC。

2）分離關(guān)節(jié)滑液中的單個(gè)核細(xì)胞

1．將關(guān)節(jié)滑液置含肝素（終濃度5IU/ml）的離心管中，離心1000×g 15分鐘。

2．用含2％滅活小牛血清的Hanks液懸浮沉淀細(xì)胞并洗滌細(xì)胞1次，每次離心1000×g 15分鐘。用含2％滅活小牛血清的Hanks液懸浮細(xì)胞至原容量。

3．用淋巴細(xì)胞分離液分離關(guān)節(jié)滑液中的單個(gè)核細(xì)胞，并用含10％小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞配成適當(dāng)濃度。

3）分離組織中的單個(gè)核細(xì)胞

1．取外科分離的各種組織，用含1％慶大霉素和1％小牛血清的MEM培養(yǎng)液洗滌組織塊，洗去可能的污染物。將組織塊置培養(yǎng)皿中，加入約為組織塊體積510倍的同樣MEM培養(yǎng)液。用無(wú)菌外科剪刀將組織塊剪碎成0.5mm³大小。

2．將組織塊轉(zhuǎn)移到小培養(yǎng)瓶中，靜置片刻，吸去培養(yǎng)液。加入約2倍組織塊體積的、濾過(guò)除菌的酶溶液。37℃水浴搖床中消化1～2小時(shí)，注意組織塊的消化程度。

3．當(dāng)組織塊消化分散后，用手用力搖晃培養(yǎng)瓶3～5分鐘或用大口吸管反復(fù)吹打，使細(xì)胞團(tuán)進(jìn)一步分散。加入30ml上述MEM培養(yǎng)液，終止酶反應(yīng)。

4．讓上述懸液通過(guò)200目的金屬網(wǎng)或尼龍網(wǎng)，分離單個(gè)細(xì)胞。用上述MEM培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，每次離心1000×g 10分鐘。用1％臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞活力并計(jì)數(shù)細(xì)胞。

5．如果細(xì)胞量較多（>10⁷），應(yīng)當(dāng)用上述淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞，并用含10％小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞配成適當(dāng)濃度。

4）從小鼠胸腺中分離胸腺細(xì)胞

1．脫臼或剪頭處死小鼠，置75％乙醇中浸泡消毒。腹面向上固定，剪開(kāi)小鼠胸腔，暴露和摘取胸腺。在平皿中用Hanks液洗凈血液，去除結(jié)締組織。

2．在有少量細(xì)胞培養(yǎng)液的平皿中，用鑷子梳理胸腺，再用大口吸管反復(fù)吹打，分離單個(gè)細(xì)胞。離心沉淀細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1次。加入適量細(xì)胞培養(yǎng)液，靜置5分鐘，讓大的組織塊自然沉降，吸出單個(gè)胸腺細(xì)胞。

3．用1％臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞活力，計(jì)數(shù)細(xì)胞。再用含10％小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞配成適當(dāng)濃度。