50~100 mL 細(xì)菌培養(yǎng)液中純化200 μg高純度質(zhì)粒DNA

1. 質(zhì)?？截悢?shù)：純化中低拷貝的質(zhì)粒時(shí)，使用2倍的菌液體積，2倍的Buffer A1,B1,C1,100%乙醇，相同體積的Wash Buffer （70% 乙醇）和Elution Buffer.
2. 轉(zhuǎn)化菌：若為-70^oC甘油凍存的菌，請先涂布平板培養(yǎng)后，再重新挑選新的單個(gè)菌落進(jìn)行培養(yǎng)。切勿直接取凍存在4℃的菌進(jìn)行培養(yǎng)。
3. 柱結(jié)合能力：250 μg

1. 取50 µL新鮮的菌液接種到15-50 mL （勿超過 50 mL）的LB培養(yǎng)基（含適量抗生素），37^oC震蕩培養(yǎng)14-16小時(shí)。室溫下5,000 x g離心10分鐘，收集菌體，并盡可能的吸去上清。
2. 加入2.5 mL Buffer A1（確保已加入RNase A），用移液器或渦流震蕩確保細(xì)菌沉淀重新懸浮。
3. 加入 2.5 mL Buffer B1, 輕輕地反轉(zhuǎn)5-10 次以混合均勻，然后靜置2-5分鐘至溶液粘稠而澄清。 
4. 加入3.0 mL Buffer C1, 立即反轉(zhuǎn)5次，用手用力搖晃3-5次充分混勻，此時(shí)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。
5. 將裂解液轉(zhuǎn)移至過濾器中，放在一個(gè)15 mL的試管上靜置10分鐘。管中的白色絮狀沉淀浮上來，對準(zhǔn)15 mL的管向下壓，使裂解液盡可能多的通過，有些裂解液可能會殘留在沉淀中。注：靜置10 分鐘時(shí)RNase A將工作，排除RNA污染。
6. 加入3.0 mL 100% 乙醇，立即搖勻，需馬上離心過DNA柱。
7. 立即轉(zhuǎn)移6.0 mL裂解液/收集管至帶收集管的DNA柱中，室溫下> 2,500 x g 離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。重復(fù)此步直至所有的溶液通過DNA柱。
8. 可選: 向DNA柱中加入 3.0 mL Buffer KB, 室溫下> 2,500 x g 離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。
9. 向離心柱中加入4.0 mL 70% 乙醇，室溫下>2,500 x g 離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。重復(fù)步驟“9”。
10. 將離心柱放回高速離心機(jī)中，室溫下>2,500 x g 開蓋離心10分鐘，以*去除殘留的乙醇。
11. 將離心柱轉(zhuǎn)至一個(gè)新的15 mL離心管中，向DNA柱膜的正中加入0.5-1 mL滅菌ddH₂O（pH在7.0-8.5之間）或Elution Buffer，室溫放置1分鐘，>2,500 x g離心5分鐘，以洗脫質(zhì)粒DNA。若想提高得率，將15 mL離心管中的洗脫液再加到柱的中間，>2,500 x g離心5分鐘以洗脫質(zhì)粒DNA。