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經(jīng)藥物代謝酶CYP450 IC50抑制體外評(píng)估模型解析一文，我們明確了國(guó)家藥監(jiān)局藥審中心發(fā)布的《藥物相互作用研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》[1]及國(guó)際人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)理事會(huì)（ICH）發(fā)布的《M12：藥物相互作用》[2]指導(dǎo)原則對(duì)于藥物-藥物相互作用（DDI）研究的目標(biāo)和方向，即代謝酶介導(dǎo)的藥物相互作用聚焦在底物/酶表型、抑制劑及誘導(dǎo)劑三個(gè)方面。經(jīng)過可逆性IC50抑制作用體外模型評(píng)估，本篇文章將從藥物體外代謝細(xì)胞色素P450（Cytochrome P450, CYP酶）的反應(yīng)表型研究方面進(jìn)行闡述。

Keywords: CYP450, Cytochrome P450, Enzyme metabolism phenotype, DDI

一、藥物CYP450酶表型代謝研究

藥物代謝鑒定研究，通常被稱為反應(yīng)表型研究，用于確定有助于藥物主要消除途徑的代謝酶的類型、數(shù)量和相對(duì)貢獻(xiàn)率。根據(jù)指導(dǎo)原則可知位于肝臟細(xì)胞滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的細(xì)胞色素P450（Cytochrome P450，CYP）酶系催化的藥物代謝是人體內(nèi)主要的藥物代謝方式之一，因此，在人體試驗(yàn)前開展合理的體外代謝試驗(yàn)評(píng)估CYP450酶與在研藥物之間的關(guān)系極為重要！

如果藥物主要通過單一的代謝途徑對(duì)藥物進(jìn)行清除，可能會(huì)存在很大的用藥風(fēng)險(xiǎn)；反之，如果某一藥物的代謝過程涉及的代謝酶越多，則說明其代謝途徑也越多，也就難以發(fā)生潛在的藥物-藥物相互作用，使得患者之間的治療偏差降低。如下圖所示：以西尼地平為例，IPHASE采用肝微粒體體外溫孵技術(shù)，研究西尼地平與幾種臨床常用藥物間的代謝相互作用的實(shí)例，結(jié)果表明環(huán)孢素、紅霉素和辛伐他丁在體外表現(xiàn)出對(duì)西尼地平代謝的抑制作用，由于三者均是CYP3A的抑制劑或底物，這提示西尼地平與CYP3A的抑制劑或底物合用時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)代謝上的相互作用，使西尼地平的代謝速率降低，西尼地平二氫吡啶環(huán)脫氫代謝物生成減少，而原型藥物的水平顯著提高，這可能會(huì)影響臨床療效的正常發(fā)揮。

綜上所述，如果合用的藥物具有潛在的抑制或誘導(dǎo)代謝酶的能力，則前者將受到合用藥物的影響，從而使其代謝清除途徑發(fā)生量化的改變，這種藥物相互作用可能會(huì)影響治療效果，增加藥物的治療失敗率，甚至誘發(fā)不良反應(yīng)。因此，通過對(duì)代謝酶表型的體外研究來判定該化合物的主要代謝酶亞型，已成為藥物臨床前代謝研究工作中不可少的一部分。

二、藥物CYP450酶表型代謝研究方法

據(jù)《藥物相互作用研究技術(shù)指導(dǎo)原則《（試行）》和《M12：藥物相互作用》指出：如果物質(zhì)平衡研究表明代謝是藥物的重要消除機(jī)制，基于物質(zhì)平衡研究估計(jì)貢獻(xiàn)≥25%藥物消除的代謝途徑涉及的代謝酶通常應(yīng)被鑒定。這適用于CYP酶和非CYP酶。于前者而言，最常研究的是CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4這7種酶亞型。

多種源自人體肝臟的體外系統(tǒng)可用于考察藥物潛在的藥物相互作用。

亞細(xì)胞的人肝組織組分，如微粒體系統(tǒng)，肝組織勻漿 9000 g離心后的上清液（S9）和胞漿（必要時(shí)加入合適輔因子），建議使用至少有10個(gè)供體的混合人肝微粒體（Human Liver Microsomes, HLM）；

源于多種表達(dá)系統(tǒng)的重組CYP酶或非CYP酶，可用于考察單一藥物代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和特定同工酶的參與；

人肝細(xì)胞，包括新鮮制備的肝細(xì)胞和冷凍保存（Cryopreserved）的肝細(xì)胞，它們可保存細(xì)胞及酶結(jié)構(gòu)并包含完整的I相和II相藥物代謝酶。

其中進(jìn)行CYP450的酶表型鑒定主要使用選擇性抑制劑、重組人源CYP450 同工酶法及相關(guān)性分析法這3種方法。選擇性抑制法又分為化學(xué)抑制法和抗體抑制法，即在加入和不加入一系類CYP450酶亞型選擇性化學(xué)抑制劑或抗體的條件下，分別測(cè)定人肝微粒體對(duì)藥物的代謝活性，以考察人肝微粒體中CYP450酶亞型倍選擇性抑制后，藥物的代謝是否受到影響，從而計(jì)算相對(duì)抑制百分率，推斷CYP450酶代謝表型。其中，化學(xué)抑制法由于其操作簡(jiǎn)單，且價(jià)格低廉而得到廣泛應(yīng)用。

三、藥物代謝酶CYP450代謝表型數(shù)據(jù)分析

鑒于此，IPHASE以肝微粒體為孵育體系，輔以NADPH再生系統(tǒng)，采用化學(xué)抑制法，分別以終濃度為1 μM α-萘黃酮、100 μM 毛果蕓香堿、50 μM 噻氯匹定、10 μM 奎尼丁、100 μM 二乙基二硫代氨基甲酸鈉、1 μM 酮康唑及20μM 磺胺苯吡唑作為CYP 1A2、CYP 2A6、CYP 2C19、CYP2D6、CYP 2E1、CYP 3A4及CYP 2C9等7種亞型酶的特異性選擇性抑制劑，以不含抑制劑的情況為空白對(duì)照，測(cè)定某一藥物在大鼠、小鼠和人肝微粒體中的主要代謝酶亞型，孵育時(shí)長(zhǎng)為0min和30min,并采用LC-MS/MS進(jìn)行原型藥物濃度的檢測(cè)。抑制率%=（1- 加入抑制劑樣品代謝速率/空白對(duì)照樣品代謝速率）×100%。

以下結(jié)果為結(jié)合真實(shí)案例的模擬數(shù)據(jù)，以便與大家共同學(xué)習(xí)成長(zhǎng)。

圖1. 大鼠肝微粒中某藥物的代謝抑制率

圖2. 犬肝微粒中某藥物的代謝抑制率

圖3. 人肝微粒中某藥物的代謝抑制率

由上圖可知，不同種屬微粒體中，該候選藥物的代謝抑制率存在明顯差異，即在大鼠中，是CYP2C19為主要代謝酶亞型，而在人中則是CYP1A2，且大鼠和人微粒體的代謝抑制率都表示出了多種酶亞型對(duì)某藥物的協(xié)同代謝；相比之下，犬微粒體對(duì)該種藥物的代謝僅有3個(gè)酶的共同作用，且代謝整體較前兩者而言漸緩。因此，不同種屬微粒體中參與藥物代謝的酶亞型可能不同，這便于更好理解藥物的開發(fā)及應(yīng)用方向。

除化學(xué)抑制法外，IPHASE以HEK293為載體，構(gòu)建人源重組蛋白CYP1A2，以相同藥物進(jìn)行酶代謝表型試驗(yàn)驗(yàn)證。期間，重組CYP1A2終濃度為0.2mg/ml，藥物終濃度為1uM，輔以NADPH再生系統(tǒng)，采用底物消除法，驗(yàn)證0min，5min，10min及15min時(shí)間下的代謝情況，結(jié)果如下圖所示。

綜上所述，我們可觀察到使用IPHASE 重組酶CYP1A2同該藥物進(jìn)行孵育后，該藥物具有明顯代謝，說明CYP1A2是該種藥物的主要代謝酶亞型之一，符合化學(xué)抑制法的驗(yàn)證結(jié)果。因此，無論是化學(xué)抑制法還是重組酶法，都可以確認(rèn)藥物CYP450酶的代謝表型，且兩者相輔相成，可互相支撐。

然而，試驗(yàn)總是伴隨著不同的結(jié)果，不同的試驗(yàn)體系也可能出現(xiàn)不同的結(jié)果。因此，IPHASE/匯智和源結(jié)合過去的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)，整理并總結(jié)了常見的問題及分析結(jié)果，同大家一同學(xué)習(xí)成長(zhǎng)！

1、化學(xué)抑制法和重組酶法結(jié)果不一致時(shí)該如何解釋？

答：這兩種代謝系統(tǒng)出現(xiàn)的任何差異都不應(yīng)該叫不一致，而是代謝系統(tǒng)自身的差異導(dǎo)致的正常現(xiàn)象。肝微粒體是直接提取的肝臟的組分，是一種同源的代謝系統(tǒng)，而重組酶是通過蛋白表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出來的，是一種非同源的測(cè)試系統(tǒng)，所以結(jié)論中以化學(xué)抑制法的結(jié)果為主，重組酶法的結(jié)果為輔。

2、是否必須采用化學(xué)抑制法和重組酶法兩種方法試驗(yàn)？

答：代謝表型研究是定性研究，目前的法規(guī)和行業(yè)觀點(diǎn)都認(rèn)為單一方法無法得出足夠可靠的結(jié)論，需兩種方法結(jié)合起來做結(jié)論。但一般也認(rèn)為，結(jié)論中以化學(xué)抑制法的結(jié)果為主，重組酶法的結(jié)果為輔。

3、什么情況下需要考慮進(jìn)行UGT表型研究？

答：在有證據(jù)表明UGT是主要代謝酶的情況下需要考慮進(jìn)行UGT表型研究；UGT表型研究只采用重組酶法來進(jìn)行，并無UGT亞型特異性抑制劑可采用，但需要注意的是，CYP和UGT甚至包括其他的代謝酶，都可能同時(shí)是主要的代謝途徑。

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鑒于此，IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者，以肝微粒體為孵育體系，輔以NADPH再生系統(tǒng)、0.1M PBS緩沖液及CYP1A2、CYP2B6、CYP2C19、CYP2D6、CYP2C8、CYP3A4和CYP2C9的特異性抑制劑，開發(fā)了化學(xué)抑制法CYP450 酶代謝表型研究試劑盒，最后通過底物消除法確認(rèn)結(jié)果。此外，為了方便客戶的驗(yàn)證，IPHASE也以HEK293為細(xì)胞載體，自研構(gòu)建多種CYP重組酶，為客戶提供多種選擇！

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