細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一。利用凍存技術(shù)將細(xì)胞置于一196~C液氮中低溫保存，可以使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來，這樣在需要的時(shí)候再復(fù)蘇細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。而且適度地保存一定量的細(xì)胞，可以防止因正在培養(yǎng)的細(xì)胞被污染或其他意外事件而使細(xì)胞丟種，起到了細(xì)胞保種的作用。除此之外，還可以利用細(xì)胞凍存的形式來購買、寄贈(zèng)、交換和運(yùn)送某些細(xì)胞。 細(xì)胞凍存時(shí)向培養(yǎng)基中加入保護(hù)劑--終濃度5％．15％的甘油或二甲基亞砜（DMSO），可使溶液冰點(diǎn)降低，加之在緩慢凍結(jié)條件下，細(xì)胞內(nèi)水分透出，減少了冰晶形成，從而避免細(xì)胞損傷。 采用"慢凍快融"的方法能較好地保證細(xì)胞存活。標(biāo)準(zhǔn)冷凍速度開始為-1 到 -2℃／min，當(dāng)溫度低于-25℃時(shí)可加速，到-80℃之后可直接投入液氮內(nèi)（-196℃）。復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)則直接將裝有細(xì)胞的凍存管投入40℃熱水中迅速解凍。

材料：凍存管，離心管，細(xì)胞培養(yǎng)用材料，500 mL燒杯，膠布，搪瓷杯，75％酒精棉。

藥品：培養(yǎng)基（RPMI1640或DMEM），小牛血清，0．25％胰蛋白酶溶液，二甲基亞砜（DMSO）或甘油，0．5％臺(tái)盼藍(lán)染液，液氮。

儀器：4℃冰箱，-70℃冰箱，液氮容器，微量加樣器，水浴鍋，離心機(jī)。

（一）細(xì)胞凍存

1．取待凍存的細(xì)胞用胰酶消化（見相關(guān)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞傳代培養(yǎng)部分），用培養(yǎng)基將細(xì)胞沖洗下來。800 r/min離心5 min，棄上清收集細(xì)胞。如果是懸浮生長的細(xì)胞，則可直接離心收集細(xì)胞。

2．加入適量凍存液（10％甘油+90％培養(yǎng)基，或者10％DMSO+90％培養(yǎng)基）制成細(xì)胞懸液。細(xì)胞濃度宜大，3×106個(gè)／mL左右，并可適量增加牛血清濃度至20％。

3．細(xì)胞懸液裝入凍存管中。用膠布封裹，做好標(biāo)記（寫上細(xì)胞種類、時(shí)間及凍存條件等）。

4．凍存管在4℃下存放30 min，轉(zhuǎn)放-20℃ 1.5～2 h，再轉(zhuǎn)人-70℃ 4-12 h后即可轉(zhuǎn)移到液氮內(nèi)（-196℃），注意進(jìn)行登記。

（二）細(xì)胞復(fù)蘇

1．取一搪瓷杯盛上適量自來水加熱至40℃左右。

2．從液氮中取出凍存管立即投人40℃水中迅速解凍。

3．取出凍存管，用75％酒精清潔管口，打開。

4．離心去上清收集細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基洗1次，加人3 mL新鮮培養(yǎng)基，于小培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

5．每日觀察細(xì)胞生長情況，如果死細(xì)胞較多，復(fù)蘇次日應(yīng)換液。待細(xì)胞長滿后可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。