細胞培養(yǎng)：細胞凍存與復蘇

細胞凍存是細胞保存的主要方法之一。利用凍存技術將細胞置于一196~C液氮中低溫保存，可以使細胞暫時脫離生長狀態(tài)而將其細胞特性保存起來，這樣在需要的時候再復蘇細胞用于實驗。而且適度地保存一定量的細胞，可以防止因正在培養(yǎng)的細胞被污染或其他意外事件而使細胞丟種，起到了細胞保種的作用。除此之外，還可以利用細胞凍存的形式來購買、寄贈、交換和運送某些細胞。 細胞凍存時向培養(yǎng)基中加入保護劑--終濃度5％．15％的甘油或二甲基亞砜（DMSO），可使溶液冰點降低，加之在緩慢凍結條件下，細胞內(nèi)水分透出，減少了冰晶形成，從而避免細胞損傷。 采用"慢凍快融"的方法能較好地保證細胞存活。標準冷凍速度開始為-1 到 -2℃／min，當溫度低于-25℃時可加速，到-80℃之后可直接投入液氮內(nèi)（-196℃）。復蘇細胞時則直接將裝有細胞的凍存管投入40℃熱水中迅速解凍。

材料：凍存管，離心管，細胞培養(yǎng)用材料，500 mL燒杯，膠布，搪瓷杯，75％酒精棉。

藥品：培養(yǎng)基（RPMI1640或DMEM），小牛血清，0．25％胰蛋白酶溶液，二甲基亞砜（DMSO）或甘油，0．5％臺盼藍染液，液氮。

儀器：4℃冰箱，-70℃冰箱，液氮容器，微量加樣器，水浴鍋，離心機。

（一）細胞凍存

1．取待凍存的細胞用胰酶消化（見相關實驗細胞傳代培養(yǎng)部分），用培養(yǎng)基將細胞沖洗下來。800 r/min離心5 min，棄上清收集細胞。如果是懸浮生長的細胞，則可直接離心收集細胞。

2．加入適量凍存液（10％甘油+90％培養(yǎng)基，或者10％DMSO+90％培養(yǎng)基）制成細胞懸液。細胞濃度宜大，3×106個／mL左右，并可適量增加牛血清濃度至20％。

3．細胞懸液裝入凍存管中。用膠布封裹，做好標記（寫上細胞種類、時間及凍存條件等）。

4．凍存管在4℃下存放30 min，轉(zhuǎn)放-20℃ 1.5～2 h，再轉(zhuǎn)人-70℃ 4-12 h后即可轉(zhuǎn)移到液氮內(nèi)（-196℃），注意進行登記。

（二）細胞復蘇

1．取一搪瓷杯盛上適量自來水加熱至40℃左右。

2．從液氮中取出凍存管立即投人40℃水中迅速解凍。

3．取出凍存管，用75％酒精清潔管口，打開。

4．離心去上清收集細胞，用無血清培養(yǎng)基洗1次，加人3 mL新鮮培養(yǎng)基，于小培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

5．每日觀察細胞生長情況，如果死細胞較多，復蘇次日應換液。待細胞長滿后可進行傳代培養(yǎng)。