基因敲除原理 我們是利用CRISPR/Cas9基因敲除系統(tǒng)，CRISPR是一種來(lái)源于細(xì)菌免疫系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)，能精確識(shí)別靶細(xì)胞DNA片段中靶點(diǎn)的核苷酸序列，利用核酸內(nèi)切酶蛋白對(duì)DNA靶點(diǎn)序列進(jìn)行切割，產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂，斷裂將在體內(nèi)被細(xì)胞修復(fù)機(jī)制修復(fù)，其中，非同源末端連接NHEJ這種修復(fù)將產(chǎn)生短的核酸插入或刪除，其帶來(lái)的基因移碼突變，將導(dǎo)致提前出現(xiàn)終止密碼子，從而完成對(duì)靶細(xì)胞DNA目的基因片段的敲除。在PAM片段上游設(shè)計(jì)sgRNA后，通過(guò)構(gòu)建基因敲除載體，結(jié)合慢病毒系統(tǒng)，可以實(shí)現(xiàn)外源基因的整合，利用抗生素或熒光，最終篩選出成功實(shí)現(xiàn)基因敲除的細(xì)胞。 CRISPR/Cas9基因敲除系統(tǒng)服務(wù)優(yōu)勢(shì)： （1）廣泛適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，脫靶率更低 （2）提高轉(zhuǎn)染率，減低細(xì)胞毒性，縮短實(shí)驗(yàn)周期 基因敲除細(xì)胞株的項(xiàng)目流程： （1）項(xiàng)目評(píng)估（免費(fèi)） （2）細(xì)胞抗生素敏感濃度摸索與單克隆形成驗(yàn)證 （3）sgRNA設(shè)計(jì)與敲除載體構(gòu)建 （4）慢病毒包裝與轉(zhuǎn)染 （5）陽(yáng)性多克隆篩選 （6）陽(yáng)性單克隆篩選 （7）敲除驗(yàn)證 基因敲除服務(wù)周期：根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)特性與基因不同，服務(wù)周期在5～10周不等。 服務(wù)流程：                      客戶提供：靶細(xì)胞及其培養(yǎng)方案、基因名稱 交付標(biāo)準(zhǔn)：1×基因敲除陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株（復(fù)蘇）                   1×項(xiàng)目結(jié)題報(bào)告 服務(wù)保證： （1）項(xiàng)目啟動(dòng)后，密切跟進(jìn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)展，每?jī)芍苓M(jìn)行一次項(xiàng)目進(jìn)度匯報(bào)。 （2）項(xiàng)目結(jié)題報(bào)告包含sgRNA序列、實(shí)驗(yàn)詳細(xì)記錄、測(cè)序結(jié)果及分析等，滿足客戶后期論證材料需求。 （3）基因敲除陽(yáng)性單克隆均經(jīng)過(guò)靶標(biāo)片段T載體克隆測(cè)序驗(yàn)證，保證基因敲除。 【案例分享】CRISPR/Cas9基因敲除細(xì)胞株構(gòu)建 1 抗生素敏感濃度摸索?? 將細(xì)胞如下圖1稀釋。給藥7天后，棄培養(yǎng)液，用臺(tái)盼藍(lán)染色2 min，顯微鏡下觀察細(xì)胞存活情況。確定細(xì)胞多克隆細(xì)胞篩選和單克隆細(xì)胞篩選濃度。                                       圖1 抗性濃度摸索 2 單克隆形成驗(yàn)證 細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞懸液稀釋混勻后加入96孔板，用封口膠將孔板封好，放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。靜置培養(yǎng)48 h后每日觀察并記錄單克隆形成情況。 3 靶標(biāo)基因sgRNA 設(shè)計(jì) 根據(jù)基因序列信息，設(shè)計(jì) sgRNA。 4 位點(diǎn)序列信息確認(rèn) PCR擴(kuò)增（圖2），測(cè)序驗(yàn)證基因序列，以確定sgRNA區(qū)域有無(wú)SNP。                                 圖2 靶標(biāo)序列擴(kuò)增 5 敲除載體構(gòu)建 退火，連接，轉(zhuǎn)化，涂板（LB/Amp）培養(yǎng)。 每個(gè)實(shí)驗(yàn)組各挑取6個(gè)單克隆菌落，于LB/ Amp培養(yǎng)基中擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒提取效果（圖3）。                                             圖3 質(zhì)粒抽提 酶切驗(yàn)證 ：取3個(gè)單克隆酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切效果（圖4）。選擇2個(gè)樣品送樣測(cè)序。                                圖4 單克隆酶切驗(yàn)證 6 慢病毒包裝 敲除載體無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取，病毒包裝。 7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 配制梯度病毒稀釋液，細(xì)胞于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48h。 8 陽(yáng)性多克隆細(xì)胞株篩選 9 陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株篩選 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，更換培養(yǎng)基，篩選至對(duì)照組大部分細(xì)胞死亡，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)行單克隆篩選。幾天后挑選陽(yáng)性單克隆進(jìn)行擴(kuò)增，并取樣驗(yàn)證。  10 陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株驗(yàn)證 1、測(cè)序驗(yàn)證 提取陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株的基因組，將靶標(biāo)基因酶切克隆至T載體后測(cè)序，以確定是否敲除成功。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果示例： 該基因有兩個(gè)單克隆細(xì)胞株，A1和A2。 單克隆細(xì)胞A1的目的基因在sgRNA2位置出現(xiàn)兩種突變形式，分別缺失1個(gè)和19個(gè)堿基，在新序列的第337位和第355位堿基提前出現(xiàn)終止密碼子。 單克隆細(xì)胞A2的目的基因在sgRNA2位置發(fā)生突變，插入1個(gè)堿基，在新序列的第340位堿基提前出現(xiàn)終止密碼子。