DNA限制性酶切及凝膠電泳，實(shí)驗(yàn)原理及方法
實(shí)驗(yàn)原理（凝膠電泳）
一. DNA的限制性內(nèi)切酶酶切分析
限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上,并切割雙鏈DNA。它可分為三類:Ⅰ類和Ⅲ類酶在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾（甲基化）作用且依賴于ATP的存在。Ⅰ類酶結(jié)合于識別位點(diǎn)并隨機(jī)的切割識別位點(diǎn)不遠(yuǎn)處的DNA，而Ⅲ類酶在識別位點(diǎn)上切割DNA分子,然后從底物上解離。Ⅱ類由兩種酶組成: 一種為限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶）,它切割某一特異的核苷酸序列; 另一種為獨(dú)立的甲基化酶,它修飾同一識別序列。Ⅱ類中的限制性內(nèi)切酶在分子克隆中得到了廣泛應(yīng)用，它們是重組DNA的基礎(chǔ)。絕大多數(shù)Ⅱ類限制酶識別長度為4至6個核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列（如EcoRⅠ識別六個核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'）,有少數(shù)酶識別更長的序列或簡并序列。Ⅱ類酶切割位點(diǎn)在識別序列中,有的在對稱軸處切割,產(chǎn)生平末端的DNA片段（如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3'）;有的切割位點(diǎn)在對稱軸一側(cè),產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性未端, 如EcoRⅠ切割識別序列后產(chǎn)生兩個互補(bǔ)的粘性末端。
5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3'
3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'
DNA純度、緩沖液、溫度條件及限制性內(nèi)切酶本身都會影響限制性內(nèi)切酶的活性。大部分限制性內(nèi)切酶不受RNA或單鏈DNA的影響。當(dāng)微量的污染物進(jìn)入限制性內(nèi)切酶貯存液中時,會影響其進(jìn)一步使用,因此在吸取限制性內(nèi)切酶時,每次都要用新的吸管頭。如果采用兩種限制性內(nèi)切酶,必須要注意分別提供各自的zui適鹽濃度。若兩者可用同一緩沖液,則可同時水解。若需要不同的鹽濃度,則低鹽濃度的限制性內(nèi)切酶必須首先使用,隨后調(diào)節(jié)鹽濃度,再用高鹽濃度的限制性內(nèi)切酶水解。也可在*個酶切反應(yīng)完成后，用等體積酚/氯仿抽提，加0.1倍體積3mol/L NaAc和2倍體積無水乙醇，混勻后置-70℃低溫冰箱30分鐘，離心、干燥并重新溶于緩沖液后進(jìn)行第二個酶切反應(yīng)。
DNA限制性內(nèi)切酶酶切圖譜又稱DNA的物理圖譜，它由一系列位置確定的多種限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)組成，以直線或環(huán)狀圖式表示。在DNA序列分析、基因組的功能圖譜繪制、DNA的無性繁殖、基因文庫的構(gòu)建等工作中，建立限制性內(nèi)切酶圖譜都是*的環(huán)節(jié)，近年來發(fā)展起來的RFLP（限制性片段長度多態(tài)性）技術(shù)更是建立在它的基礎(chǔ)上。
構(gòu)建DNA限制性內(nèi)切酶圖譜有許多方法。通常結(jié)合使用多種限制性內(nèi)切酶，通過綜合分析多種酶單切及不同組合的多種酶同時切所得到的限制性片段大小來確定各種酶的酶切位點(diǎn)及其相對位置。酶切圖譜的使用價值依賴于它的準(zhǔn)確性和程度。
在酶切圖譜制作過程中，為了獲得條帶清晰的電泳圖譜，一般DNA用量約為0.5-1μg。限制性內(nèi)切酶的酶解反應(yīng)zui適條件各不相同,各種酶有其相應(yīng)的酶切緩沖液和zui適反應(yīng)溫度（大多數(shù)為37℃）。對質(zhì)粒DNA酶切反應(yīng)而言, 限制性內(nèi)切酶用量可按標(biāo)準(zhǔn)體系1μg DNA加1單位酶,消化1-2小時。但要*酶解則必須增加酶的用量,一般增加2-3倍,甚至更多,反應(yīng)時間也要適當(dāng)延長。
二. 凝膠電泳瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳是分離鑒定和純化DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。該技術(shù)操作簡便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度離心法）所無法分離的DNA片段。當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶（Ethidium bromide, EB）染色,在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶,從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外,還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶,用于以后的克隆操作。
瓊脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各種形狀、大小和孔隙度。瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣,不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度從200bp至近50kb的DNA片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強(qiáng)度和方向恒定的電場下電泳。聚丙烯酰胺分離小片段DNA（5-500bp）效果較好,其分辯力*,甚至相差1bp的DNA片段就能分開。聚丙烯酰胺凝膠電泳很快,可容納相對大量的DNA,但制備和操作比瓊脂糖凝膠困難。聚丙烯酰胺凝膠采用垂直裝置進(jìn)行電泳。目前,一般實(shí)驗(yàn)室多用瓊脂糖水平平板凝膠電泳裝置進(jìn)行DNA電泳。
瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質(zhì),其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場中,在中性pH值下帶負(fù)電荷的DNA向陽極遷移,其遷移速率由下列多種因素決定:
1、 DNA的分子大小:
線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。
2、 瓊脂糖濃度
一個給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。分離小于0.5kb的DNA片段所需膠濃度是1.2-1.5%,分離大于10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%, DNA片段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。
3、 DNA分子的構(gòu)象
當(dāng)DNA分子處于不同構(gòu)象時,它在電場中移動距離不僅和分子量有關(guān),還和它本身構(gòu)象有關(guān)。相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動速度是不一樣的,超螺旋DNA移動zui快,而線狀雙鏈DNA移動zui慢。如在電泳鑒定質(zhì)粒純度時發(fā)現(xiàn)凝膠上有數(shù)條DNA帶難以確定是質(zhì)粒DNA不同構(gòu)象引起還是因?yàn)楹衅渌鸇NA引起時,可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個回收,用同一種限制性內(nèi)切酶分別水解,然后電泳,如在凝膠上出現(xiàn)相同的DNA圖譜,則為同一種DNA。
4、 電源電壓
在低電壓時,線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強(qiáng)度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長,片段越大,因場強(qiáng)升高引起的遷移率升高幅度也越大,因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率達(dá)到zui大,所加電壓不得超過5v/cm。
5、嵌入染料的存在
熒光染料溴化乙啶用于檢測瓊脂糖凝膠中的DNA,染料會嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使其剛性更強(qiáng),還會使線狀DNA遷移率降低15％。

6、 離子強(qiáng)度影響
電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時（如誤用蒸餾水配制凝膠）,電導(dǎo)率zui小,DNA幾乎不移動,在高離子強(qiáng)度的緩沖液中（如誤加10×電泳緩沖液）,則電導(dǎo)高并明顯產(chǎn)熱,嚴(yán)重時會引起凝膠熔化或DNA變性。
對于天然的雙鏈DNA,常用的幾種電泳緩沖液有TAE[含EDTA （pH8.0）和Tris-乙酸],TBE（Tris-硼酸和EDTA）,TPE（Tris-磷酸和EDTA）,一般配制成濃縮母液,儲于室溫。
第二節(jié) 材料、設(shè)備及試劑
一、 材料
λDNA: 購買或自行提取純化; 重組pBS質(zhì)料或pUC19質(zhì)粒; EcoRI酶及其酶切緩沖液: 購買成品; HindⅢ酶及其酶切緩沖液: 購買成品;瓊脂糖（Agarose）: 進(jìn)口或國產(chǎn)的電泳用瓊脂糖均可。
二、 設(shè)備
水平式電泳裝置,電泳儀,臺式高速離心機(jī), 恒溫水浴鍋, 微量移液槍, 微波爐或電爐,紫外透射儀, 照相支架, 照相機(jī)及其附件。
三、 試劑
1、 5×TBE電泳緩沖液：配方見*章。
2、 6×電泳載樣緩沖液：0.25％ 溴粉藍(lán)，40％（w/v） 蔗糖水溶液，貯存于 4℃。
3、溴化乙錠（EB）溶液母液:將EB配制成10mg/ml,用鋁箔或黑紙包裹容器,儲于室溫即可。
第三節(jié) 操作步驟凝膠電泳
一、 DNA酶切反應(yīng)
1、將清潔干燥并經(jīng)滅菌的eppendorf管（0.5ml）編號,用微量移液槍分別加入DNA 1μg和相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶反應(yīng)10×緩沖液2μl,再加入重蒸水使總體積為19μl,將管內(nèi)溶液混勻后加入1μl酶液,用手指輕彈管壁使溶液混勻,也可用微量離心機(jī)甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整個實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵,要防止錯加，漏加。使用限制性內(nèi)切酶時應(yīng)盡量減少其離開冰箱的時間，以免活性降低。
2、混勻反應(yīng)體系后,將eppendorf管置于適當(dāng)?shù)闹С治锷希ㄈ绮逶谂菽芰习迳希?37℃水浴保溫2-3小時,使酶切反應(yīng)*。
3、 每管加入2μl 0.1mol/L EDTA（pH8.0）,混勻,以停止反應(yīng),置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?br />二、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的制備
采用EcoRⅠ或HindⅢ酶解所得的λDNA片段來作為電泳時的分子量標(biāo)準(zhǔn)。λDNA為長度約50kb的雙鏈DNA分子,其商品溶液濃度為0.5mg/ml,酶解反應(yīng)操作如上述。HindIII切割 DNA后得到8個片段,長度分別為23.1, 9.4, 6.6, 4.4, 2.3, 2.0, 0.56和0.12kb。EcoRI切割lDNA后得到6個片段,長度 分別為21.2, 7.4, 5.8, 5.6, 4.9和2.5kb。
三、 瓊脂糖凝膠的制備
1、取5×TBE緩沖液20ml加水至200ml,配制成0.5×TBE稀釋緩沖液,待用。
2、 膠液的制備：稱取0.4g瓊脂糖,置于200ml錐形瓶中,加入50ml 0.5×TBE稀釋緩沖液,放入微波爐里（或電爐上）加熱至瓊脂糖全部熔化,取出搖勻,此為0.8％瓊脂糖凝膠液。加熱過程中要不時搖動,使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液。加熱時應(yīng)蓋上封口膜,以減少水份蒸發(fā)。
3、膠板的制備：將有機(jī)玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏（寬約1cm）緊密封住。將封好的膠槽置于水平支持物上,插上樣品梳子,注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持1mm左右的間隙。
向冷卻至50-60℃的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠（EB）溶液使其終濃度為0.5μg /ml（也可不把EB加入凝膠中,而是電泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色）。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內(nèi)側(cè),待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內(nèi),使膠液形成均勻的膠層。倒膠時的溫度不可太低,否則凝固不均勻,速度也不可太快,否則容易出現(xiàn)氣泡。待膠*凝固后撥出梳子,注意不要損傷梳底部的凝膠,然后向槽內(nèi)加入0.5×TBE稀釋緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。因邊緣效應(yīng)樣品槽附近會有一些隆起,阻礙緩沖液進(jìn)入樣品槽中,所以要注意保證樣品槽中應(yīng)注滿緩沖液。
4、 加樣：取10μl酶解液與2μl 6×載樣液混勻,用微量移液槍小心加入樣品槽中。若DNA含量偏低,則可依上述比例增加上樣量,但總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個樣品要更換tip頭,以防止互相污染,注意上樣時要小心操作,避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。
5、電泳：加完樣后,合上電泳槽蓋,立即接通電源。控制電壓保持在60-80V,電流在40mA以上。當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動到距凝膠前沿約2cm時,停止電泳。
6、染色：未加EB的膠板在電泳完畢后移入0.5μg/ml的EB溶液中,室溫下染色20-25分鐘。
7、觀察和拍照：在波長為254nm的短波紫外燈（LEC-160L）下觀察染色后的或已加有EB的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。紫光燈下觀察時應(yīng)戴上紫外線防護(hù)眼鏡或有機(jī)玻璃面罩,以免損傷眼睛。經(jīng)照相機(jī)鏡頭加上近攝鏡片和紅色濾光片后將相機(jī)固定于照相架上，采用全色膠片，光圈5.6,曝光時間10-120秒（根據(jù)熒光條帶的深淺選擇）。
8、 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：在放大的電泳照片上,以樣品槽為起點(diǎn),用卡尺測量λDNA的EcoRⅠ和HindⅢ酶切片段的遷移距離,以厘米為單位。以核苷酸數(shù)的常用對數(shù)為縱坐標(biāo),以遷移距離為橫坐標(biāo),在坐標(biāo)紙上繪出連結(jié)各點(diǎn)的平滑曲線,即為該電泳條件下DNA分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
9、 DNA酶切片段大小的測定：在放大的電泳照片上,用卡尺量出DNA樣品各片段的遷移距離,根據(jù)此數(shù)值,在DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的對數(shù)值,進(jìn)一步計(jì)算出各片段的分子量大?。ㄈ粲脝螌?shù)坐標(biāo)紙來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,則可根據(jù)遷移距離直接查出DNA片段的大?。?。反之,若已知DNA片段的大小亦可由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它預(yù)計(jì)的遷移距離。
10 DNA酶切片段排列順序的確定：根據(jù)單酶切,雙酶切和多酶切的電泳分析結(jié)果,對照DNA酶切片段大小的數(shù)據(jù)進(jìn)行邏輯推理,然后確定各酶切片段的排列順序和各酶切位點(diǎn)的相對位置。以環(huán)狀圖或直線圖表示,即成該DNA分子的限制性內(nèi)切酶圖譜。
[注意] 1.酶切時所加的DNA溶液體積不能太大，否則DNA溶液中其他成分會干擾酶反應(yīng)。
2、酶活力通常用酶單位（U）表示，酶單位的定義是：在zui適反應(yīng)條件下，1小時*降解1mg lDNA的酶量為一個單位，但是許多實(shí)驗(yàn)制備的DNA不象lDNA那樣易于降解，需適當(dāng)增加酶的使用量。反應(yīng)液中加入過量的酶是不合適的，除考慮成本外，酶液中的微量雜質(zhì)可能干擾隨后的反應(yīng)。
3、市場銷售的酶一般濃度很大，為節(jié)約起見，使用時可事先用酶反應(yīng)緩沖液（1×）進(jìn)行稀釋。另外，酶通常保存在50%的甘油中，實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)將反應(yīng)液中甘油濃度控制在1/10之下，否則，酶活性將受影響。
4、觀察DNA離不開紫外透射儀,可是紫外光對DNA分子有切割作用。從膠上回收DNA時,應(yīng)盡量縮短光照時間并采用長波長紫外燈（300-360nm）,以減少紫外光切割DNA。
5、 EB是強(qiáng)誘變劑并有中等毒性,配制和使用時都應(yīng)戴手套,并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經(jīng)專門處理后才能清洗或丟棄。
6、當(dāng)EB太多,膠染色過深,DNA帶看不清時,可將膠放入蒸餾水沖泡,30分鐘后再觀察。