1.試劑和溶液

1）轉(zhuǎn)印緩沖液：0.025M Tris base , 0.187 M甘氨酸 , 25%甲醇

2）氨基黑溶液：0.1% 酸性黑10B

3）1×TBST：25mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 0.2 M NaCl ,0.1%Tween 20

4）封閉液：TBST配制的5%牛奶

5）抗體稀釋液：TBST配制的5%牛奶

6）顯色系統(tǒng)：ECL顯色

2.實驗步驟

1電泳：將裂解液進行SDS-PAGE電泳，80v，30分鐘，120v，90分鐘；

2轉(zhuǎn)膜：PVDF膜在甲醇中浸泡約30秒左右，濾紙浸泡在轉(zhuǎn)印緩沖液預濕，半干法轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，10v，150分鐘；

3染色：氨基黑染色5分鐘，甲醇褪去背景色，觀察條帶；

4膜活化：將PVDF膜置于甲醇活化1min，用純水洗膜2次后再用TBST洗滌3次；

5封閉：將膜條置于5%牛奶或2% BSA中，室溫混搖2h；

6一抗孵育：將待檢抗體用3%牛奶或2% BSA稀釋到合適濃度（參照抗體說明書，根據(jù)客戶預實驗結果，稀釋度上下浮動一個數(shù)量級都為正常），將膜放入對應的已稀釋待檢樣品中，置4℃混搖孵育隔夜；

7洗滌：取出膜放在TBST中洗滌3×5min；

8二抗孵育：將膜取出放入稀釋好的HRP標記的二抗（參照二抗說明書進行稀釋）中，室溫混搖2h；

9洗滌：取出膜放在TBST中洗滌3×5min；

10ECL顯色：將膜取出放入混勻的ECL顯色液中，孵育3min，將膜取出貼在有熒光角標的膠片上，迅速用保鮮膜包好；

11曝光：把底片放在暗盒中，根據(jù)熒光強度分別對X光膠片作不同時間段的曝光，曝光結束后，將底片取出，1min顯影，30s清洗，1min定影，30s清洗，晾干；

12結果分析：用掃描儀將曝光后的X光膠片掃描，做后續(xù)結果分析。

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主要提供一下耐藥細胞株的建立：

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人結腸癌長春新堿耐藥株

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人卵巢癌順鉑耐藥株

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人胃癌順鉑耐藥株

人白血病阿霉素耐藥株

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人肝癌氟尿嘧啶耐藥株

人乳腺癌抗雌激素耐藥株

人乳腺癌Tamoxifen耐藥株

小鼠激素依賴性乳腺癌細胞

服務周期

1. 有現(xiàn)成的細胞系：6個月，具體時間根據(jù)客戶的要求以及樣本數(shù)而定；

2. 沒有已建成的細胞系，需要構建，公司構建時間約為15個月左右。

公司熱賣耐藥株：K562/Adr細胞，BIU-87/Adr細胞，A549/DDP細胞，NCI-H446/VP細胞，A549/Taxol細胞，A549/DDP細胞，H1975/培美曲塞細胞，BEL-7402/FU細胞，HCT-8/VCR細胞，HCT-8/FU細胞，HCT-8/Taxol細胞，A2780/Taxol細胞，A2780/DDP細胞，MCF-7/Adr細胞，Eca-109/VCR細胞，SGC-7901/DDP細胞，PATU-8988/FU細胞，PATU-8988/FU細胞，HCT116/L-OHP細胞，LOVO/ADR細胞，SGC7901/DDP細胞，SGC7901/VCR細胞，L1210/DDP細胞，H446/VP細胞，COC1/DDP細胞，HepG2/ADR細胞等。